《Food Chemistry Advances》：Non-covalent Buckwheat Protein-Rutin Complexation for Improved Functional Biopolymer Film-Forming Powder using Physical Mixing Process and Dialysis Techniques
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关于芦丁与荞麦蛋白（BWP）相互作用的研究信息较为匮乏，尤其是荞麦蛋白的非共价键合作用仍未被充分探索。本研究采用物理混合工艺和透析技术（3.5 kDa管径），考察了芦丁（2%和4%）在0–4小时内与荞麦蛋白的偶联程度。研究人员采用标准方法定量透析液中的未结合芦
关于芦丁与荞麦蛋白（BWP）相互作用的研究信息较为匮乏，尤其是荞麦蛋白的非共价键合作用仍未被充分探索。本研究采用物理混合工艺和透析技术（3.5 kDa管径），考察了芦丁（2%和4%）在0–4小时内与荞麦蛋白的偶联程度。研究人员采用标准方法定量透析液中的未结合芦丁，以芦丁当量测定透析冻干成膜溶液（FFS）的总酚含量（TPC），并评估其抗氧化潜力。2%和4%添加量的计算总结合芦丁量呈剂量依赖性增加，数值分别为98.56–111.17 mg和198.17–232.56 mg。4%芦丁成膜溶液的总酚含量增幅最高，达240.04%–577.37%，而2%芦丁成膜溶液的增幅为202.68%–493.53%（p < 0.0001）。这表明总酚含量的增加是荞麦蛋白成膜溶液中蛋白质-芦丁结合形成的函数。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示蛋白质骨架畸变不显著。研究结果表明，形成稳定的蛋白质-芦丁复合物取决于多种环境因素，尤其是pH、温度和离子强度，这些因素介导了蛋白质-多酚相互作用的强度与类型。
**一、研究背景与问题——为何开展这项研究**
随着环保高性能功能性食品包装需求的日益增长，以可持续膳食蛋白质为基础的生物聚合物作为石油基聚合物的替代品受到广泛关注。石油衍生的涂层（如石蜡和聚乙烯）虽常用于果蔬保鲜，但无营养价值，甚至可能掩盖腐败、含有吗啉等添加剂，并截留农药和污物。荞麦（Fagopyrum esculentum）蛋白因其具有包含九种必需氨基酸的完全蛋白质谱、良好的成膜能力和天然健康促进作用而备受关注。然而，蛋白质虽具备良好的结构特征，其功能性有限，限制了其在活性食品包装中的应用。将具有生物活性的植物多酚掺入成膜蛋白质基质已成为改善荞麦蛋白膜功能特性的有效策略。芦丁是一种丰富的黄酮醇糖苷，具有强抗氧化、金属螯合和抗炎特性，其酚羟基可通过氢键、疏水相互作用及特定氧化条件下的潜在共价键与蛋白质氨基酸侧链结合，进而改变蛋白质构象、网络密度与形态。然而，形成蛋白质-芦丁复合物所需的适宜芦丁添加量、不同孵育反应时间的影响以及透析介导的未结合芦丁去除对复合物稳定性的影响仍未得到系统研究。目前关于通过物理混合和透析技术制备荞麦蛋白-芦丁复合物的研究资料十分稀缺，其在pH 8、室温、不同反应时间及透析条件下的特性、稳定性和功能性在很大程度上未被探索。因此，本研究旨在开发一种基于室温物理混合与透析复合途径的芦丁结合蛋白基质生物聚合物成膜溶液，以阐明该相互作用诱导的功能增强与活性变化，同时保持蛋白质结构。
**二、主要技术与方法**
本研究采用以下关键技术手段（样本来源：荞麦粉购自美国纽约Birkett Mills公司）：（1）碱溶酸沉法提取荞麦蛋白：将荞麦粉与去离子水混合，调pH至9.0进行蛋白质溶解，离心取上清，调pH至4.5等电点沉淀蛋白质，冻干得荞麦蛋白粉；（2）物理混合法制备成膜溶液：将甘油、果胶和荞麦蛋白依次加入去离子水，调pH至8.0，分别加入2%和4%（w/w蛋白质）芦丁，室温下600 rpm持续搅拌0–4小时；（3）透析纯化技术：采用3.5 kDa分子量截留透析膜对成膜溶液进行24小时透析（前6小时室温，后18小时4°C），去除未结合芦丁；（4）紫外-可见分光光度法（UV-Vis）：在354 nm处定量透析液中的未结合芦丁浓度，计算结合效率；（5）Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（TPC）；（6）DPPH自由基清除法测定Trolox等效抗氧化能力（TEAC）；（7）衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析蛋白质-芦丁相互作用与结构变化。
**三、研究结果——通过什么研究得出什么结论**
**3.1 提取及提取后残渣得率**
通过碱溶酸沉法从荞麦粉中回收的蛋白质占初始面粉质量的6.22% ± 0.07。残渣占93.78% ± 0.07，主要为碳水化合物、细胞壁成分以及部分变性或不溶性蛋白质、脂质、灰分和多酚。低提取率可能归因于淀粉、膳食纤维和脂肪的存在阻碍了蛋白质溶解。值得注意的是，大量残渣可能在食品加工技术中具有额外价值，可作为功能性食品配料或生物聚合物膜增强剂。
**3.2 透析液中未结合芦丁的紫外-可见分光光度检测与定量**
未处理对照组（BPRT0）表现出时间依赖性小信号下降（34.9 mg至29.6 mg），表明荞麦蛋白粗提物中存在内源性芦丁信号。扣除对照信号后，2%芦丁处理组（BPRT2）的实际未结合芦丁量从51.4 mg降至38.8 mg，4%芦丁处理组（BPRT4）从101.8 mg降至67.4 mg，均呈现随孵育时间增加而降低的趋势（p < 0.0001和p = 0.0053）。这表明延长孵育时间为蛋白质-芦丁相互作用提供了更多机会，减少了可自由扩散的芦丁量。计算总结合芦丁量方面，BPRT2在98.6 mg至111.2 mg范围内无显著时间差异，而BPRT4从198.17 mg增至232.56 mg，随孵育时间显著增加。结合效率随0–4小时逐渐上升（BPRT2从65.7%升至74.1%，BPRT4从66.1%升至77.5%），但结合效率未随芦丁浓度成比例提高，提示较高芦丁添加量虽增加了总结合量，但因蛋白质结合位点逐渐饱和而未显著提升结合效率。因此，荞麦蛋白-芦丁相互作用似乎更依赖于孵育时间而非芦丁浓度。
**3.3 透析冻干荞麦蛋白-芦丁成膜粉末中结合芦丁的定量：总酚含量和Trolox等效抗氧化能力（TEAC）-DPPH分析**
总酚含量随芦丁掺入显著增加（p < 0.05），BPRT2和BPRT4均显著高于对照组。BPRT4的总酚含量增幅为240.04%–577.37%，BPRT2为202.68%–493.53%（p < 0.0001）。扣除对照值后，2%和4%芦丁添加对酚含量的净贡献相当（p > 0.05），表明较高芦丁掺入水平下的可测量酚类保留有限，可能归因于蛋白质结合位点的渐进饱和和空间位阻。该研究证实总酚含量的增加是荞麦蛋白-芦丁结合形成的函数。然而，与初始假设不同，芦丁添加未带来预期的抗氧化性能显著提升。BPRT0对照组在整个0–4小时混合期间保持稳定的抗氧化能力（6.50–6.58 μmol TE/g），源于天然荞麦蛋白提取物中固有的抗氧化氨基酸和生物活性肽序列。BPRT2和BPRT4的抗氧化值与对照相当甚至略低，缺乏线性剂量依赖性增加。这可能反映了芦丁酚羟基被包埋于蛋白质基质中导致其可利用性受限，以及蛋白质网络中的截留、聚集或空间位阻阻碍了芦丁与测试自由基的功能性相互作用。此外，DPPH方法仅捕获供氢或自由基淬灭活性，其他抗氧化机制（如金属螯合、酶调节）可能未被检测到。
**3.4 荞麦蛋白-芦丁复合物的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析**
FTIR光谱显示，对照和芦丁改性样品中均保留了特征吸收带：3261.62–3267.56 cm
-1处的O–H和N–H伸缩振动、1631.09–1631.46 cm
-1处的酰胺I带（C=O伸缩）、1529.94–1530.22 cm
-1处的酰胺II带（N–H弯曲和C–N伸缩）以及2918.29–2921.03 cm
-1处的C–H伸缩振动。无论芦丁浓度和混合时间如何，酰胺I、酰胺II和羟基区域均仅观察到可忽略的峰位偏移，指纹区（1200–1000 cm
-1）也保持不变，表明蛋白质二级结构未被显著改变，未形成新的共价键。这证实芦丁通过弱非特异性相互作用（如氢键或物理包埋）掺入蛋白质基质，而非强化学键合或显著构象改变。芦丁的特征芳香和酚类峰未在光谱中出现，表明芦丁信号被蛋白质主带重叠，进一步支持缺乏强蛋白质-芦丁结合。
**四、讨论与结论**
**3.5 局限性与未来方向**
研究人员指出本研究存在若干局限性：提取的荞麦蛋白未使用Kjeldahl、Dumas或Bradford等验证方法独立表征纯度；透析虽去除了未结合芦丁，但未能完全去除蛋白质提取物中天然存在的非蛋白组分；354 nm的UV-Vis定量可能受其他天然UV吸收化合物干扰，属于间接定量方法。未来研究方向包括独立蛋白质纯度评估，采用荧光光谱、等温滴定量热法、液相色谱-质谱联用（LC-MS）或高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）等更先进仪器分析技术进行结合态和游离态芦丁的确定性表征及复合机制研究。此外，干膜制备、力学性能和阻隔性能的表征（拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过率、氧气阻隔性、不透明度、溶解度、含水量、颜色、形态等）留待未来利用优化配方进行膜流延研究。
**结论**
本研究通过室温物理混合和透析复合方法，成功开发了具有非共价蛋白质-芦丁复合物的冻干成膜粉末。2%和4%芦丁添加量均表现出65.7%–77.5%的计算结合效率，总酚含量显著增加，同时FTIR证实蛋白质骨架结构未受到显著干扰，表明芦丁主要通过与荞麦蛋白的弱非共价相互作用（氢键、疏水相互作用）掺入蛋白质基质。研究证实蛋白质-多酚结合的强度与类型受pH、温度和离子强度等多重环境因素调控。尽管抗氧化活性未呈预期剂量依赖性增强，但该简单物理共混技术为功能性荞麦蛋白组分的绿色制备提供了可行途径。该冻干荞麦蛋白-芦丁成膜粉末作为功能性可食膜在食品包装应用中的前景值得进一步研究和全面表征。论文发表于《Food Chemistry Advances》。
