通过共价修饰增强维生素B2掺入纳米纤维膜的光稳定性用于抗菌光动力灭活

《Food Chemistry: X》：Enhanced photostability of vitamin B 2 incorporated nanofibrous membrane via covalent modification for antimicrobial photodynamic inactivation

　　

维生素B₂（VB₂）是一种天然光敏剂，在光照下持续产生杀灭性活性氧（ROS），使其成为控制食源性病原体污染的有前景候选物。然而，VB₂的光诱导自降解限制了其长期抗菌应用。在本研究中，研究人员将VB₂的核糖醇侧链共价连接至聚乙烯醇-乙烯共聚物（EVOH）纳米纤维膜上。这种共价固定增加了分子内氢抽提的吉布斯自由能，从而阻碍了VB₂的光降解。所得VB₂–EVOH在D65和UVA照射下，在多个光暴露循环中表现出持续且稳定的ROS生成，·OH、H₂O₂和¹O₂的产率分别维持在209.89、208.82和204.41 μg g^?1 h^?1。有效的ROS生成导致在60分钟光照射后大肠杆菌（Escherichia coli）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）减少约6 log，并且这种有前景的抗菌效果在连续五个抗菌循环中保持，无明显下降。此外，VB₂–EVOH展示了在包装草莓上减少各种病原菌的能力，同时不显著损害其品质，突出了其在食品相关领域的潜在应用。

食源性疾病暴发频繁，严重威胁人类健康。食品接触表面是病原微生物转移至食品的关键途径，减少其污染是保障食品安全的重要策略。现有抗菌剂（如银化合物、多酚、精油）存在化学不可逆消耗导致效力下降的问题，限制了长效保护。抗菌光动力灭活（aPDI）策略通过光敏剂（PS）持续产生活性氧（ROS）备受关注，但传统PS（如TiO₂纳米颗粒、卟啉类）的固有毒性限制了其在食品接触材料中的应用。天然维生素B₂（核黄素，VB₂）无毒且能产生ROS，但光诱导自降解（通过分子内氢抽提生成光活性有限的光色素）导致其光稳定性差，限制了长效抗菌应用。为此，研究人员通过共价接枝将VB₂固定于聚乙烯醇-乙烯共聚物（EVOH）纳米纤维膜上，以抑制分子内氢抽提、增强光稳定性。该研究成功制备了VB₂–EVOH膜，实现了持续ROS生成、高效广谱抗菌且可重复使用，并在草莓保鲜中验证了其应用潜力，成果发表于《Food Chemistry: X》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：静电纺丝技术制备EVOH纳米纤维膜；氰尿酰氯（CC）介导的共价接枝反应，将VB₂的核糖醇侧链与EVOH骨架连接；利用密度泛函理论（DFT）计算分析分子内氢抽提的吉布斯自由能变化；通过电子顺磁共振（EPR）定性检测ROS类型，并采用p-NDA法、KI法和L-组氨酸法分别定量·OH、H₂O₂和¹O₂；使用扫描电子显微镜（SEM）观察细菌形态变化；以大肠杆菌（E. coli）和单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）为模型菌进行抗菌实验；选用当地市场采购的草莓作为食品模型，评估VB₂–EVOH在真实贮藏条件下的抗菌效果及对品质的影响。

**3.1 制备与表征**
研究人员通过静电纺丝制备EVOH纳米纤维膜，再经CC介导共价接枝VB₂，获得VB₂–EVOH膜（接枝率2.20±0.14%）。SEM显示纤维直径300–500 nm，孔隙结构完整。FTIR和XPS证实了VB₂与EVOH间共价键（COC）的形成。UV-vis-DRS表明，经24 h UVA照射后，物理共混膜VB₂/EVOH吸收峰几乎消失，而VB₂-EVOH光谱变化极小，证实共价修饰显著增强了VB₂的光稳定性。细胞毒性（CCK-8）实验显示细胞活力>94%，溶血率<1.2%，且2周浸出实验未检测到VB₂泄漏，表明材料安全性良好。该策略具有规模化生产潜力。

**3.2 光活性机制**
TD-DFT计算与UV-vis-DRS结果表明，VB₂–EVOH保留了与自由VB₂相似的光激发路径（S₀→S₁/S₃），T₁态形成主要来自HOMO–LUMO跃迁（贡献87.19%），且HOMO/LUMO电子密度分布几乎一致，说明聚合物环境对VB₂光活性核心的电子影响极小。ESP分析指出，N(1)位为初始氢抽提最活跃位点，N(5)可能为次级氢抽提位点，共价接枝对光反应位点影响甚微。

**3.3 增强的光稳定性用于ROS生成**
DFT计算显示，VB₂–EVOH中分子内氢抽提距离（4.5491 ?和6.8374 ?）显著长于VB₂（2.5631 ?和3.4398 ?），且分子内氢抽提吉布斯自由能（ΔG_intra）从?145.26 kJ mol^?1升至?31.10 kJ mol^?1，表明共价接枝热力学上抑制了自降解。分子间氢抽提ΔG_inter仅略有升高（?483→?469 kJ mol^?1），表明I型反应活性基本保留。EPR实验确认了·OH和¹O₂的生成。循环ROS定量实验表明，VB₂–EVOH在D65和UVA照射下，H₂O₂和¹O₂产率持续稳定（如H₂O₂：272.46和208.82 μg g^?1 h^?1），而VB₂/EVOH在数个循环后产率急剧下降，证实共价修饰显著增强了光稳定性。

**3.4 光诱导抗菌活性与机制**
抗菌动力学实验显示，VB₂–EVOH在UVA或D65照射60 min内完全灭活E. coli和L. monocytogenes（>6 log CFU mL^?1），且对李斯特菌更敏感（30 min完全灭活）。循环抗菌实验表明，VB₂–EVOH在五个连续循环中均保持>6.67 log的灭活效果，而VB₂/EVOH仅维持两个循环后活性显著下降。SEM观察到VB₂–EVOH照射后细菌细胞膜塌陷、变形，DNA和蛋白质泄漏显著增加，证实ROS破坏细胞膜是主要抗菌机制。

**3.5 概念验证演示**
以草莓为食品模型，人工接种混合病原菌（E. coli、金黄色葡萄球菌S. aureus、L. monocytogenes，约7 log CFU mL^?1）后，用VB₂–EVOH膜包裹并在D65下连续照射7天。结果表明，VB₂–EVOH组在第5天完全灭活E. coli，第6天灭活S. aureus和L. monocytogenes，而EVOH组仅实现有限减少。VB₂–EVOH还抑制了真菌生长。品质监测显示，VB₂–EVOH组草莓的pH升高幅度更小（3.21→3.95 vs EVOH组3.21→4.15），红度（Δa*）损失更少，且硬度保持更好，表明其在保持食品品质的同时有效杀菌。

**总结讨论与结论**
研究人员通过共价接枝策略成功开发了VB₂–EVOH纳米纤维膜，该膜通过限制核糖醇侧链的构象灵活性，升高分子内氢抽提吉布斯自由能，从而抑制VB₂光降解，增强光稳定性。所得膜在持续光照下稳定产生·OH、H₂O₂和¹O₂，赋予其广谱、高效（>6 log CFU mL^?1）且可重复使用的抗菌性能。在草莓保鲜应用中，该膜有效灭活病原菌并维持果实品质，展示了在食品相关领域的应用潜力。结论为：本研究通过共价接枝将VB₂固定于EVOH聚合物骨架，核糖醇侧链的结构约束导致分子内氢抽提吉布斯自由能显著升高，从而增强了VB₂的光稳定性。所得VB₂–EVOH膜在光照下持续产生ROS，·OH、H₂O₂和¹O₂的产率分别达到209.89、208.82和204.41 μg g^?1 h^?1。光生ROS赋予VB₂–EVOH广谱抗菌活性、高杀菌效率（>6 log CFU mL^?1）和良好的可重复使用性。此外，作为抗菌食品包装膜，VB₂–EVOH在保持水果品质的同时有效灭活了采后草莓上的病原菌。尽管VB₂–EVOH展现出有前景的抗菌潜力，但在实际商业化前仍需进一步开展迁移评估、法规评价及大规模包装验证等研究。