基于人工神经网络 - 遗传算法的紫色红曲霉 Y146 产酯酶优化及其在发酵酒风味增强中的应用

《Food Microbiology》：Optimization of Esterase Production from Monascus purpureus Y146 by Artificial Neural Network-Genetic Algorithm and Its Application in Flavor Enhancement of Fermented Wine

　　

摘要

酯酶在食品发酵过程中的风味调节中起着重要作用。本研究采用一株高产酯酶菌株紫红红曲霉 Y146，通过单因素实验（OFAT）、响应面法（RSM）以及结合遗传算法的人工神经网络（ANN-GA）方法来优化酯酶产量。对酯酶进行了部分纯化和表征，并使用 HS-SPME-GC-MS 评估了其在米酒发酵中的应用。结果表明，在 16% 的种子接种量、84 h 时添加 10 g/L L-精氨酸、pH 7 以及发酵 8.69 d 的条件下，Y146 菌株的酯酶活性高达 1248.02 U/mL，较未优化条件提高了 4.68 倍。部分纯化的酯酶制剂在 30 °C 和 pH 7 时表现出最佳活性，在存在 2 mM Fe²⁺时活性增强，半衰期约为 9 h。HS-SPME-GC-MS 分析鉴定出葵酸乙酯是对照组中检测到的唯一香气活性化合物（OAV > 1）。添加部分纯化的酯酶制剂后，观察到挥发性化合物的多样性和丰度增加，香气活性化合物的数量从一种增加到六种，包括十一酸乙酯、己酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、月桂醇和 2,4-二叔丁基苯酚。这些发现突显了紫红红曲霉 Y146 来源的部分纯化酯酶制剂在风味导向的发酵食品系统中的潜在应用。

引言

酯类化合物是酒中的关键香气活性物质，其组成和浓度在风味形成和表达中起着至关重要的作用 (Xu 等，2022)。发酵过程中，酯酶催化酯键的水解和合成，在酯代谢中发挥核心作用。因此，酯酶因其在风味调节、香气合成和生物催化中的应用而引起了广泛关注 (Lee & Trinh, 2020; Mussakhmetov & Silayev, 2025; Xu 等，2022)。

微生物是酯酶的主要工业来源，这得益于其生产周期短、环境适应能力强以及易于培养和遗传或发酵调控 (Kruis 等，2019)。其中，红曲霉属 在传统发酵食品和米酒中尤为重要，它们被广泛用作功能性发酵剂，因为它们能产生红曲色素、生物活性代谢物和胞外水解酶，包括酯酶、蛋白酶和淀粉酶，这些酶有助于底物降解和香气形成 (Xu 等，2021)。先前的研究表明，红曲霉属 菌株产生的酯酶参与食品发酵过程中特征性香气酯的形成。M. purpureus M1 产生的酯酶可在红曲奶酪中形成己酸乙酯和辛酸乙酯等关键香气化合物，而Monascus YJX-8 产生的酯酶则有助于戊酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯的形成 (Xu 等，2021; Zeng 等，2022)。其他与食品相关的微生物产生的酯酶也被报道具有类似的促香功能。Saccharomyces cerevisiae Y285 产生的酯酶与白酒中己酸乙酯的形成密切相关，而Lacticaseibacillus casei LC6117 产生的酯酶促进多种关键酯的形成，从而丰富产品风味 (Fang 等，2025; Pang 等，2023)。然而，微生物酯酶的生产和催化性能受发酵条件强烈影响，这限制了其在食品发酵中的实际应用。因此，提高酯酶产量对于扩大其在风味导向发酵过程中的潜力至关重要。

传统的优化方法，如 OFAT 和 RSM，已被广泛应用于提高酶的产量。然而，当发酵系统表现出非线性和多个变量之间的复杂相互作用时，RSM 的二次多项式模型往往在预测准确性和优化效率方面显示出局限性 (Chong 等，2023; Dixit 等，2022)。近年来，ANN-GA 的结合有效解决了这些局限性，并已成功应用于优化各种微生物酶的发酵条件 (Hamet & Tremblay, 2017)。ANN-GA 显著提高了Thermomyces lanuginosus VAPS25 中内切葡聚糖酶 (2.7 U/mL)、淀粉酶 (5.2 U/mL) 和脂肪酶 (18.85 U/mL) 的活性 (Dixit 等，2022)。同样，该方法将Trichoderma harzianum 的酯酶活性提高至 3256.73 U/L，较 RSM 提高了 9% (Sounderarajan 等，2024)。然而，ANN-GA 在优化红曲霉属 菌株酯酶生产中的应用及其对基于红曲 发酵酒系统香气形成的后续影响在很大程度上尚未被探索。

在本研究中，紫红红曲霉 Y146 是一种此前在我们实验室分离的高酯酶活性菌株，因其具有风味导向发酵的潜在应用而被选为模式生物。初步结果表明，添加 L-精氨酸显著提高了酯酶活性至 266.79 U/mL。因此，我们假设通过 L-精氨酸补充和基于 ANN-GA 的发酵优化来提高酯酶活性，可能促进发酵米酒中香气活性酯的形成。为了验证这一假设，依次采用 OFAT、RSM 和 ANN-GA 来优化酯酶活性的发酵条件。生成的酯酶随后进行部分纯化和表征，涉及其生化特性和动力学参数，并使用 HS-SPME-GC-MS 评估其在米酒发酵中的应用潜力。这些发现为改善红曲霉属 菌株的酯酶产量以及进一步探索部分纯化酯酶制剂在米酒发酵中的应用提供了基础。

章节摘要

菌株与化学试剂

M. purpureus Y146 (CCTCC M20242077) 获得自沈阳农业大学食品科学学院。该菌株基于 ITS rDNA 测序和β-微管蛋白 (BenA) 基因序列分析进行鉴定 (图 S1)。使用 HPLC 评估了紫红红曲霉 Y146 的橘霉素生产情况，在测试条件下未观察到可检测到的橘霉素生产 (图 S2)。该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 平板上保存，并于 30 °C 培养 7 d 后接种

使用 OFAT 优化酯酶生产

OFAT 的结果见图 1 和表 1。酯酶活性最初随种子接种量的增加而上升，随后下降，在接种水平为 16% 时达到最大值 297.7 U/mL (图 1A)。这一结果表明，最佳的接种量有助于菌丝快速进入指数生长期，从而增强代谢活性。然而，过量的接种可能会加剧营养竞争并限制氧传递，最终

结论

本研究系统优化了紫红红曲霉 Y146 的发酵条件，使用了 OFAT、RSM 和 ANN-GA 策略。结果表明，最佳条件为接种量 16%、L-精氨酸浓度 10 g/L、初始 pH 7、L-精氨酸添加时间 84 h 以及发酵时间 8.69 d。在这些条件下，酯酶活性达到 1248.02 U/mL，较未优化条件提高了 4.68 倍。部分纯化的酯酶制剂

CRediT 作者贡献声明

张允宁：验证，形式分析。林美琪：方法论，形式分析。杨雪：撰写—初稿，软件，方法论，数据整理，概念化。林思旭：方法论，调查。冯畅：可视化，资源。严学锐：撰写—审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，概念化

未引用的参考文献

Xu 等，2022；Zhang 等，2025；Zhang 等，2025。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作由 辽宁省重点研发计划 资助 (2025080280-JH2/1013)。

杨雪 |林思旭 |张允宁 |林美琪 |冯畅 |严学锐

沈阳农业大学食品科学学院，中国沈阳，110866