藻类和蓝细菌藻蓝蛋白在细胞农业中作为血清白蛋白的有前景替代品

《Future Foods》：Algal and cyanobacterial phycocyanins are promising alternatives to serum albumin in cellular agriculture

　　

摘要
培养肉可能比动物肉需要更少的资源且污染更少，但其生产成本仍然高昂。培养肉科学中的关键挑战之一是识别/开发胎牛血清（FBS）替代品作为生长补充剂。在FBS中存在的众多分子中，白蛋白是最丰富的成分，对于脂肪酸的运输和血清的抗氧化活性至关重要。由于其功能重要性，研究人员正在投入大量精力寻找白蛋白替代品。本研究探索了来自蓝细菌的C-藻蓝蛋白（C-Phycocyanin）和来自红藻的R-藻蓝蛋白（R-Phycocyanin）作为培养基中白蛋白替代品的潜力，用于培养日本鹌鹑成肌细胞。研究人员使用荧光光谱法、分子对接和分子动力学研究了它们的脂肪酸结合潜力。C-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白与不饱和脂肪酸（FAs）的结合能力强于饱和脂肪酸，而α-亚麻酸表现出最高的亲和力，并确认了多个稳定的结合位点。值得注意的是，藻蓝蛋白的抗氧化活性超过了白蛋白。细胞活力测定和活死染色显示，在C-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白存在下，细胞生长得到增强。这些结果表明，C-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白能有效结合脂肪酸并支持细胞增殖，突出了它们作为功能性白蛋白替代品的潜力，这是可持续生产培养肉的重要先决条件。

藻类和蓝细菌藻蓝蛋白：细胞农业中血清白蛋白的有前景替代品——论文解读

**研究背景与问题**

全球人口预计在2050年将达到100亿，届时对肉类的需求预计将增长50%。然而，传统畜牧业效率低下，占据全球77%的农业用地却仅提供17%的食物供应，并导致约60%的农业排放和11%至19%的全球温室气体排放。在此背景下，基于动物细胞的培养肉作为一种可持续、环保且符合伦理的肉类生产方式，展现出巨大潜力。然而，培养肉的生产成本仍然高昂，主要瓶颈在于细胞培养基的成本，尤其是其中胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的使用。FBS不仅昂贵且存在伦理问题，与培养肉的动物福利初衷相悖。白蛋白是FBS中最丰富的蛋白质分，负责运输脂肪酸（Fatty Acids, FAs）和提供抗氧化活性，其成本占培养基成本的近三分之一。因此，寻找非重组、低成本、可持续的白蛋白功能替代品，是实现培养肉产业化和降低成本的关键一步。

**研究方法与技术**

为探索藻蓝蛋白作为白蛋白替代品的潜力，研究人员采用了一系列关键技术。首先，从商业螺旋藻粉（Arthrospira platensis）和紫菜（Porphyra haitanensis）中分别纯化得到C-藻蓝蛋白（C-Phycocyanin, C-PC）和R-藻蓝蛋白（R-Phycocyanin, R-PC）。通过荧光光谱法测定不同脂肪酸（饱和与不饱和）与藻蓝蛋白的结合亲和力。利用分子对接（Molecular Docking）和分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟预测并验证脂肪酸在藻蓝蛋白上的结合位点及复合物稳定性。通过还原力测定和ABTS自由基清除实验评估其抗氧化活性。最后，利用鹌鹑成肌细胞系（QM7细胞），通过中性红摄取（Neutral Red Uptake, NRU）试验、刃天青（Resazurin）试验和台盼蓝（Trypan Blue, TB）排斥试验，在脱白蛋白血清（De-albuminized Fetal Bovine Serum, DA FBS）和化学成分明确的E8培养基中，评估藻蓝蛋白对细胞活力和增殖的影响，并与重组人白蛋白进行比较。

**研究结果**

**3.1. 脂肪酸与C-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白的体外结合**
荧光光谱实验表明，C-PC和R-PC与饱和脂肪酸（如棕榈酸、硬脂酸）的结合导致藻蓝素发色团荧光的微弱淬灭（淬灭效率约10-15%），而不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸、α-亚麻酸）则引起更显著的淬灭，尤其α-亚麻酸淬灭效果最强，且曲线呈现多个平台期，表明存在多个非等价结合位点。通过Hill方程拟合，发现α-亚麻酸对两种藻蓝蛋白的亲和力最高（K_d值分别为1.9和0.7 μM），且结合位点最多。

**3.2. 通过分子对接和动力学检测藻蓝蛋白上的脂肪酸结合位点**
分子对接研究在C-PC和R-PC的六聚体结构中发现了一个位于两个三聚体单元之间的高能量结合位点，该位点远离发色团。在二聚体层面，分子动力学模拟揭示了位于β-α亚基界面的最高亲和力结合位点，该位点富含精氨酸残基，通过盐桥与脂肪酸头部结合，而其疏水尾部则与α-螺旋Hα6相互作用。模拟结果确认，α-亚麻酸在所有结合位点上的结合能均高于硬脂酸，且其与藻蓝蛋白结合后形成的复合物稳定，解离常数（K_d）在5-43 μM范围内，与荧光实验中的低亲和力位点数据吻合。两种藻蓝蛋白在结合位点和亲和力上表现出高度相似性。

**3.3. C-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白的抗氧化活性**
在还原力测定中，C-PC和R-PC的还原能力是重组白蛋白的4.5倍。在ABTS自由基清除实验中，C-PC和R-PC的清除能力也显著高于白蛋白（约2.5倍）。研究认为，藻蓝蛋白中除了半胱氨酸（Cys）残基外，其四吡咯发色团（tetrapyrrole chromophores）是贡献更强抗氧化活性的主要因素。

**3.4. 在QM7细胞培养中验证C-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白替代白蛋白的潜力**
在脱白蛋白血清（DA FBS）条件下，补充C-PC或R-PC均能显著提高QM7细胞的活力和增殖能力，其效果优于补充重组白蛋白，且接近含有0.5%完整FBS的对照组。台盼蓝排斥试验计数显示，C-PC和R-PC处理组的活细胞数量显著高于DA FBS对照组，并与0.5% FBS组的细胞数相近。在低血清（1% FBS）条件下进行的三代传代培养中，C-PC和R-PC均能持续促进QM7细胞增殖，尤其在第三代时，其促进效果甚至超过了1.5% FBS对照组，也优于重组白蛋白。在化学成分明确的E8培养基中进行的单次传代实验显示，藻蓝蛋白同样能增强细胞活力和生长，但多次传代效果不具重复性，表明其在血清饥饿初期提供支持性保护作用。

**讨论与结论**

本研究首次证明了纯化的C-PC和R-PC具备类似白蛋白的支持功能，可作为细胞培养基中白蛋白的候选替代品。尽管藻蓝蛋白对脂肪酸的亲和力（微摩尔级）低于白蛋白（纳摩尔级），但其对必需多不饱和脂肪酸（如α-亚麻酸）表现出更高的结合偏好，这有利于提升培养肉的营养价值。更重要的是，藻蓝蛋白远高于白蛋白的抗氧化活性，使其在低蛋白、低生长因子等应激条件下，能更有效地促进细胞生长和增殖。研究指出，藻蓝蛋白的规模化生产（如从螺旋藻和紫菜中提取）和成本效益高的纯化技术（如膜色谱法、双水相系统）是实现其工业应用的关键。此外，通过微胶囊化等技术提高藻蓝蛋白在培养基中的稳定性，也是未来研究的重要方向。

**研究结论**
本研究证明了两种藻蓝蛋白，即来自红藻的R-藻蓝蛋白（R-PC）和来自蓝细菌的C-藻蓝蛋白（C-PC），在培养肉的细胞培养基中提供类似白蛋白支持功能的潜力。两种藻蓝蛋白以中等至相对较高的亲和力结合脂肪酸（FAs），主要结合位点的解离常数在微摩尔级。必需的多不饱和脂肪酸对C-PC和R-PC具有最高的亲和力和多个非等价结合位点。将C-PC和R-PC添加到脱白蛋白胎牛血清（DA FBS）中，显著增强了QM7细胞的活力和增殖，并在这些实验条件下优于重组白蛋白。在化学成分明确的无血清E8培养基中，两种藻蓝蛋白在单次传代实验中也提高了QM7细胞的活力和增殖，表明其具有短期支持作用。在低血清条件下的多次传代培养中，也证明了C-PC和R-PC对QM7细胞的生长刺激活性。尽管需要进一步优化培养基并在完全无血清条件下进行系统的多次传代验证，但本研究的结果确定了藻蓝蛋白是能够在明确培养基中提供类似白蛋白支持功能的候选蛋白。识别蓝细菌和藻类藻蓝蛋白以及其他藻胆蛋白作为具有白蛋白样支持特性的蛋白质，是朝着减少培养肉培养基中对血清白蛋白依赖迈出的有希望的一步。这类蛋白质可能有助于为培养肉生产开发更可持续和更具成本效益的培养基配方。在藻胆蛋白的生产、纯化、稳定性和规模化方面的进一步进展，对于评估其在未来白蛋白减少或无血清培养基中的实际应用至关重要，尤其是在循环生物经济概念下。