层层自组装槲皮素-溶菌酶-果胶纳米颗粒通过肠道菌群调控缓解高脂饮食诱导的黑腹果蝇肠道损伤

《Industrial Crops and Products》：Layer-by-layer assembled quercetin-lysozyme-pectin nanoparticles alleviate high-fat diet-induced intestinal injury through gut microbiota modulation in Drosophila melanogaster

　　

层层自组装（LBL）的MPN-LYS-PEC纳米颗粒实现了肠道菌群靶向递送槲皮素。该纳米颗粒显示出高槲皮素包封率和结构稳定性。该纳米颗粒缓解了高脂饮食（HFD）诱导的黑腹果蝇（D. melanogaster）肠道损伤。无菌实验证实了一种依赖于肠道菌群的保护机制。

高脂饮食（HFD）是导致肠道损伤和屏障功能障碍的主要因素，并与全身代谢紊乱密切相关，其中肠道菌群失调在加剧上皮损伤和炎症反应中发挥核心作用。靶向肠道菌群以恢复肠道稳态和菌群-宿主互作平衡，成为缓解HFD诱导肠道损伤及相关代谢紊乱的潜在策略。槲皮素（quercetin）作为天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和肠道保护活性，但因其水溶性差、胃肠条件下化学不稳定及口服生物利用度低，限制了实际应用。传统口服后，槲皮素在上消化道大量降解或提前吸收，难以与肠道菌群充分相互作用。金属-酚网络（MPN）通过多酚与金属离子配位形成，可稳定槲皮素，但单独MPN的胃肠保护作用有限，需进一步结构强化。层层自组装（LBL）利用天然生物聚合物可增强纳米颗粒稳定性与位点特异性递送。溶菌酶（LYS）作为阳离子球状蛋白，具有良好生物相容性；果胶（PEC）作为阴离子多糖，能抵抗胃和小肠消化，但可被肠道菌群产生的果胶酶选择性降解，适合作为肠道菌群响应性外层。目前尚缺乏对整合LYS和PEC的三元自组装纳米颗粒用于肠道菌群靶向槲皮素递送的合理设计，尤其是纳米颗粒结构如何调控槲皮素在胃肠消化中的稳定性并转化为对肠道菌群和肠道稳态的下游调控。因此，研究人员开发了槲皮素-溶菌酶-果胶自组装纳米颗粒系统（MPN-LYS-PEC），旨在实现肠道菌群靶向递送，并评估其对HFD诱导肠道损伤的保护作用。该研究发表在《Industrial Crops and Products》。


研究人员采用溶剂交换法构建槲皮素-Fe²⁺金属-酚网络（MPN）纳米核，再通过静电层层自组装（LBL）依次包覆带正电的溶菌酶（LYS）和带负电的果胶（PEC），制备三元纳米颗粒（MPN-LYS-PEC）。利用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、热重分析（TGA）和X射线衍射（XRD）表征理化性质，测定包封率（EE）和载药量（LE），并进行体外模拟胃肠消化和铁离子浸出实验。以HFD诱导的黑腹果蝇（D. melanogaster，野生型Canton-S品系，来自上海生命科学研究院果蝇资源中心）为模型，评估纳米颗粒对体重、攀爬能力、脂质含量、抗氧化能力、肠道屏障完整性、肠道活性氧（ROS）和细胞死亡的影响，通过16S rRNA基因测序分析肠道菌群变化，并利用无菌果蝇验证菌群依赖性机制。


**3.1 结构表征**
通过SEM和TEM观察到MPN-LYS-PEC纳米颗粒呈球形、分散良好，具有清晰核壳结构；粒径从MPN（429.9 nm）依次增至MPN-LYS（550.8 nm）和MPN-LYS-PEC（608.2 nm），zeta电位从?31.1 mV反转为+30.4 mV再反转为?32.0 mV，证实层层组装成功。LYS与PEC质量比1:1时包封率最高（92.57%），载药量25.98%。UV-Vis和FTIR分析显示，槲皮素与Fe²⁺配位形成金属-酚网络，LYS与PEC通过静电和氢键作用组装。TGA/DTG和XRD表明复合物热稳定性提高，槲皮素以无定形态分散。体外模拟胃肠消化中，MPN-LYS-PEC在胃液（SGF）中2小时释放仅6.73%，肠液（SIF）中6小时释放26.65%，远低于MPN-LYS；TEM显示消化后仍保持完整球形。铁离子浸出实验表明，仅在pH 1.0时大量浸出（60.85 mg/L），在pH 3.0-9.0条件下浸出极低，表明胃肠生理条件下结构稳定。

**3.2 对果蝇体重和攀爬能力的影响**
30天干预后，MPN-LYS-PEC对雄性果蝇体重无显著影响，但使雌性果蝇体重较HFD组降低23.93%，优于MPN（17.02%）和LYS-PEC（5.30%）。攀爬能力方面，雄性果蝇各干预组间无显著差异；雌性果蝇中MPN-LYS-PEC组攀爬率（80.95%）显著高于MPN组（63.10%）。

**3.3 对脂质含量和抗氧化能力的影响**
MPN-LYS-PEC使雄性果蝇甘油三酯（TG）较HFD组降低54.75%，优于MPN（29.31%）和LYS-PEC（45.42%）；总胆固醇（T-CHO）与MPN组无显著差异但均低于HFD组。雌性果蝇中，MPN-LYS-PEC组TG较HFD组降低46.26%，总胆固醇（T-CHO）较MPN组降低20.56%。抗氧化指标：雄性果蝇MPN-LYS-PEC组超氧化物歧化酶（SOD）活性较HFD组升高68.42%，过氧化氢酶（CAT）活性较HFD组升高51.81%，丙二醛（MDA）水平较MPN组降低9.30%（无显著差异）；雌性果蝇中，MPN-LYS-PEC组SOD活性较HFD组升高233.30%，CAT活性升高56.07%，MDA水平降低28.94%，均优于MPN和LYS-PEC组。

**3.4 对肠道健康的影响**
肠道通透性检测（Smurf实验）显示，雌性果蝇中MPN-LYS-PEC组肠道渗漏率（22.14%）较MPN组（45.00%）降低50.79%，显著低于HFD组（70.00%）。二氢乙啶（DHE）染色显示，雄性果蝇MPN-LYS-PEC组荧光强度较MPN组降低19.62%，雌性组降低25.13%，均显著低于HFD组。7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色显示，雄性果蝇MPN-LYS-PEC组死细胞荧光强度较HFD组降低39.40%，雌性组较MPN组降低17.47%，均低于HFD组。

**3.5 对肠道菌群的影响**
16S rRNA测序分析显示，MPN和MPN-LYS-PEC显著降低HFD果蝇的α多样性指数（ACE、Simpson、Chao1、Shannon），主坐标分析（PCoA）显示各治疗组菌群结构向对照组（CS）靠近。变形菌门（Proteobacteria）相对丰度在MPN-LYS-PEC组回升至接近CS组水平。属水平分析表明，MPN和MPN-LYS-PEC显著增加有益菌Commensalibacter（Acetobacteraceae科，产乙酸菌）丰度，降低有害菌Novosphingobium丰度；LYS-PEC单独处理则增加Buttiauxella和Enterobacter丰度。Pearson相关性分析显示，Commensalibacter丰度与TG、T-CHO水平负相关，Novosphingobium丰度与TG正相关、与攀爬能力负相关。

**3.6 无菌果蝇验证菌群作用**
在无菌条件下，MPN-LYS-PEC处理对果蝇TG和T-CHO水平无显著影响，DHE和7-AAD染色显示肠道ROS和细胞死亡也未显著改善，证明纳米颗粒的保护作用依赖于肠道菌群。


4. 结论
综上所述，本研究成功开发了一种肠道菌群靶向纳米颗粒系统（MPN-LYS-PEC），以改善槲皮素的口服递送和生物功效。层级组装结构在胃肠转运中有效保护槲皮素，并增强其与肠道菌群相互作用的局部可利用性。在HFD喂养的黑腹果蝇中，这种菌群靶向递送缓解了脂质代谢紊乱并减轻了肠道损伤。重要的是，16S rRNA测序和无菌果蝇实验表明，重塑的肠道菌群（以Commensalibacter增加和Novosphingobium减少为特征）与观察到的代谢改善密切相关。总体而言，本研究建立了一种生物相容且有效的菌群靶向营养素递送策略，用于改善HFD诱导的肠道稳态失衡。