姜黄素烯酮联合水解酶：一种控制变异链球菌与氟康唑耐药白色念珠菌混合生物膜的有前景策略

《ACS Omega》：Zerumbone Combined with Hydrolytic Enzymes: A Promising Strategy to Control Mixed Biofilms of Streptococcus mutans and Fluconazole-Resistant Candida albicans

　　

本体外研究评估了从姜黄属植物（Zingiber zerumbet (L.) Smith）根茎中提取的倍半萜植物化学物质姜黄素烯酮（Zerumbone, ZER）单独或与葡聚糖酶（Dextranase, DEX）和脱氧核糖核酸酶I（DNase I, DNase）联用，对氟康唑敏感及氟康唑耐药白色念珠菌（Candida albicans）与变异链球菌（Streptococcus mutans）多微生物生物膜的效能。混合物种生物膜由白色念珠菌ATCC 90028（CaS）、白色念珠菌ATCC 96901（CaR）和变异链球菌UA159构建，并在抑制和破坏实验中评估。处理包括ZER、DEX和DNase单独或联合使用。通过总生物膜质量、代谢活性（CFU/mm2）及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）活/死细胞评估分析效能。数据采用单因素和双因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验（α = 0.05）。在生物膜抑制实验中，ZER及其组合（尤其是ZER + DEX）对两种白色念珠菌和变异链球菌菌株均表现出增强活性。对于CaS + Sm生物膜，ZER、ZER + DEX和DNase + DEX对CaS活力降低最大（>2.7 log10），而对变异链球菌，DNase + DEX、ZER和ZER + DEX最有效（>2.1 log10）。ZER + DEX还显著降低了CaR + Sm生物膜中的总微生物负荷。值得注意的是，ZER + DEX是唯一显著减少敏感生物膜干重的处理，并在结晶紫染色测量中对敏感和耐药生物膜均产生最高生物量降低。在生物膜破坏实验中，ZER + DNase对CaS活力降低最大（2.08 log10），而ZER和ZER + DNase对变异链球菌最有效（>2.5 log10）。对于CaR + Sm生物膜，ZER + DEX和ZER + DNase是最有效处理之一。共聚焦显微镜结果证实了这些发现，显示ZER及所有ZER联合处理在两种测试条件下均显著增加了死细胞比例。在本体外研究的局限内，ZER单独或与基质降解酶（DEX和DNase）联用，对包含氟康唑耐药株的白色念珠菌与变异链球菌混合物种生物膜的抑制和破坏均表现出增强活性，提示其作为辅助抗菌方法进一步研究的前景。

研究背景方面，口腔生物膜是龋病、牙周炎及根管感染等疾病的核心诱因，其中白色念珠菌（Candida albicans）与变异链球菌（Streptococcus mutans, S. mutans）常形成跨界（interkingdom）混合生物膜，二者协同增强致龋潜力与真菌菌丝形成，并促进坚韧细胞外基质（ECM）生成。氟康唑（fluconazole）作为口咽念珠菌病一线药物，广泛使用已导致念珠菌耐药率上升，而混合生物膜凭借ECM屏障进一步削弱常规抗菌疗效。ECM由多糖、蛋白质及胞外DNA（eDNA）构成，靶向ECM成为破局思路：水解酶如葡聚糖酶（Dextranase, DEX）可降解链球菌多糖，DNase I可切割eDNA；天然倍半萜姜黄素烯酮（Zerumbone, ZER）来自姜花根茎，兼具膜破坏与ECM解构能力。此前未见ZER与DEX、DNase联用针对含氟康唑耐药株混合生物膜的头对头比较，本研究据此在《ACS Omega》发表，填补该空白。

主要关键技术方法上，研究人员构建氟康唑敏感白色念珠菌ATCC 90028（CaS）、氟康唑耐药白色念珠菌ATCC 96901（CaR）与变异链球菌UA159双物种生物膜，设立生物膜抑制（生长中给药）与生物膜破坏（成熟后给药）两类实验；处理组为ZER（256 μg/mL）、DEX（0.5 units/mL）、DNase I（20 units/mL）及七种组合，各接触20分钟；效能终点涵盖菌落形成单位（CFU）计数、干重、结晶紫生物量、总生物膜抑制/破坏指数（TBI/TBD）及CLSM活/死染色定量；统计采用Kruskal–Wallis与Dunn检验或ANOVA与Tukey检验（α=0.05）。

研究结果部分，小标题“生物膜抑制实验中处理对氟康唑敏感与耐药白色念珠菌伴变异链球菌双物种生物膜活力的影响”下，研究人员发现ZER + DEX使CaS活力降2.82 log₁₀，ZER单药降2.74 log₁₀，DNase + DEX降2.73 log₁₀；变异链球菌以DNase + DEX（2.70 log₁₀）、ZER（2.19 log₁₀）、ZER + DEX（2.15 log₁₀）最优；CaR模型中ZER + DEX仍居前（真菌2.72 log₁₀、细菌2.21 log₁₀）。小标题“生物膜抑制实验中处理对干重、总生物膜抑制（TBI）及总生物量的影响”下，ZER + DEX是唯一显著降低CaS+Sm干重者（p<0.001），结晶紫生物量亦以ZER + DEX、ZER、DNase + DEX降幅最大；CaR+Sm中DNase + DEX的TBI最低。小标题“生物膜破坏实验中处理对双物种生物膜活力的影响”下，ZER + DNase对CaS真菌降2.08 log₁₀居首，ZER与ZER + DNase对变异链球菌降约2.6–2.7 log₁₀；CaR模型中ZER + DEX、ZER + DNase、DNase + DEX真菌降幅相近（约1.2 log₁₀）。小标题“生物膜破坏实验中处理对干重、总生物膜破坏（TBD）及总生物量的影响”下，CaS+Sm干重仅ZER + DEX显著下降，CaR+Sm中DNase + DEX与ZER + DNase + DEX干重降幅最著；生物量染色与抑制实验趋势一致。小标题“共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）”下，抑制实验中ZER单药及含ZER组合使活细胞比降至约30%（死70%），耐药模型以ZER + DEX与DNase + DEX最优（活37%）；破坏实验中ZER + DNase在敏感模型达死65%，耐药模型各含ZER组合均显著提升死细胞比例。

讨论与结论翻译部分，研究人员指出：ZER单药即可破坏病原体细胞膜并解构ECM（降低生物量、蛋白、水溶/碱溶多糖及eDNA），而DEX靶向葡聚糖、DNase I靶向eDNA，三者机制互补；在抑制场景ZER + DEX因同时打击真菌膜、细菌多糖支架与基质交联而表现最稳，在破坏成熟生物膜场景ZER + DNase因先松解脱eDNA网再透膜而占优。结论为：在本体外研究局限内，ZER单独或与基质降解酶DEX、DNase联用，对含氟康唑耐药白色念珠菌与变异链球菌的跨界混合生物膜在抑制与破坏两端均展现增强抗菌活性，支持其作为口腔抗真菌/抗龋辅助策略进入后续体内与评价毒性研究。