改进的蛋白质半合成方法使硫代酰胺破坏β-折叠相互作用的生物物理研究成为可能

《Biochemistry》：Improved Protein Semi-Synthesis Enables Biophysical Studies of Thioamide Destabilization of β-Sheet Interactions

　　

硫代酰胺是肽骨架的天然翻译后修饰，可以通过合成引入以探测蛋白质折叠或功能化肽用于转化应用。在这项工作中，研究人员证明，使用Knorr吡唑活化可以高效生成带有C端硫酯的含硫代酰胺肽，并用于随后的天然化学连接（NCL）反应以生成含硫代酰胺的蛋白质。研究人员将此方法与酰基叠氮活化进行比较，发现两种途径提供相似的产率。研究人员还研究了超声介导的连接位点半胱氨酸的脱硫作用，以寻求相对于化学自由基引发剂的潜在优势。扩大合成规模使研究人员能够研究硫代酰胺对蛋白G B1结构域（GB1）的β-折叠区域的扰动，以及帕金森病蛋白α-突触核蛋白（α-synuclein）淀粉样纤维中的β-链相互作用。在这两种情况下，研究人员观察到β-折叠网络的显著去稳定化，表现为GB1热稳定性降低以及α-突触核蛋白折叠改变和聚集减慢。这些发现说明单原子替代对协同氢键网络的影响，并促进了未来对这两个系统的研究。

硫代酰胺（thioamide）是一种肽骨架的保守修饰，其中酰胺键的羰基氧被硫原子取代，形成硫代羰基（C═S）。这种单原子替换引入独特的物理化学变化，可用于生物物理研究。然而，在蛋白质中引入硫代酰胺以研究其结构效应的传统方法（如天然化学连接，NCL）产率较低，限制了规模化应用，特别是对于需要大量样品进行结构表征和聚集动力学研究的体系（如帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白及模型蛋白GB1）。因此，研究人员旨在开发更高效的半合成方法，以制备足够量的含硫代酰胺蛋白质，从而探究硫代酰胺对β-折叠网络稳定性的影响。该研究发表于《Biochemistry》。

研究人员采用了两种主要的关键技术方法：1）Knorr吡唑活化法，利用乙酰丙酮将C端酰肼肽转化为C端硫酯，用于NCL；2）酰基叠氮活化法（使用亚硝酸钠）作为对比。此外，研究人员还尝试了超声介导的脱硫（USID）方法，以替代化学自由基引发剂（VA-044）进行连接位点半胱氨酸的脱硫。合成规模放大后，研究人员制备了GB1-LS5K13A（在GB1的Leu5位点引入硫代酰胺）和αS-LS8（在α-突触核蛋白的Leu8位点引入硫代酰胺），并分别通过圆二色光谱（CD）、核磁共振（NMR）和硫黄素T（ThT）荧光聚集实验进行了生物物理表征。

研究结果如下：

**Knorr Pyrazole Activation of GB1 N-Terminal Fragment**：通过Knorr吡唑活化，研究人员从GB1_1–12-LS5-NHNH₂高效生成C端硫酯，并与表达得到的C端片段（GB1_13–56-K13C）进行NCL，获得GB1-LS5K13C，产率38%，基于限制性试剂转化率>92%。与酰基叠氮活化相比，两种方法产率相似（38–55%），且无副产物。

**Knorr Pyrazole and Acyl Azide Activation of αS-LS8A19C**：在αS中，两种活化方法均能高效转化αS_1–18-LS8-NHNH₂为C端硫酯，并与αS_19–140-A19C进行NCL，获得αS-LS8A19C，转化率约60%，但分离产率仅约10%，归因于αS特异性纯化损失。

**Desulfurization of Ligation Site Cysteine**：使用VA-044（加硫代乙酰胺防止硫代酰胺脱硫）对连接位点半胱氨酸进行脱硫，GB1-LS5K13C在3小时内完成，分离产率56%；αS-LS8A19C需过夜反应，产率25%。超声脱硫（USID）方法虽可行，但速度较慢且引入少量硫代酰胺脱硫副产物，故VA-044仍为优选。

**Biophysical Characterization of GB1**：CD热变性实验表明，GB1-LS5K13A的熔解温度（T_m = 60.7 ± 0.1 °C）比伪野生型GB1-K13A（T_m = 68.2 ± 0.3 °C）低7.5 °C，解折叠自由能变化（ΔΔG_U）为?1.6 kcal mol^–1，表明显著去稳定化。NMR（¹H–¹H TOCSY）显示，GB1-LS5K13A的指纹区（NH, Hα）交叉峰与母体GB1-K13A不重叠，表明硫代酰胺引入导致GB1折叠显著破坏，与晶体学尝试失败一致。

**Aggregation Kinetics of Thioamide-Containing αS**：在αS聚集实验中，将αS-LS8与野生型αS以不同比例混合，加入10%预成型纤维种子，监测ThT荧光。与野生型αS的半最大信号时间（T_1/2 = 8.5 h）相比，25%、50%和100% αS-LS8的T_1/2分别延长至6.9、12.5和43.9 h。凝胶分析显示，最终不溶性聚集物总量相似，但100% αS-LS8几乎无ThT荧光，表明其形成更无定形的聚集体，而非典型纤维。这一结果出乎意料，因为Leu8位于大多数冷冻电镜（cryo-EM）结构中未解析的N端区域，暗示该位点通过氢键网络参与纤维核心形成。

讨论部分总结：研究人员指出，单原子替换对β-折叠网络的影响显著，在GB1中表现为结构广泛去稳定化，在αS中则显著延缓纤维化并改变聚集途径。这些发现与Kelly等人在Aβ肽中的骨架等排体研究结果一致，表明即使位于无序区域，骨架修饰也能深刻影响聚集。未来研究需进一步探索不同位置硫代酰胺的效应，并利用其他等排体（如E-烯烃、N-甲基酰胺、酯）完全消除供体/受体功能，以解析氢键网络在淀粉样蛋白形成中的作用。研究结论翻译如下：研究硫代酰胺与氧酰胺在肽和蛋白质中的结构与功能差异，有助于理解天然硫代酰胺修饰的作用，并更好地将其用作生物物理探针或肽修饰剂。本工作证明，含C端酰肼的硫代酰胺肽可通过乙酰丙酮活化为Knorr吡唑生成C端硫酯用于NCL，且两种活化方法均可规模化，提供足够量的GB1和αS用于先前难以开展的研究。在这两种情况下，对蛋白质折叠的影响显著，引发了后续实验的新问题。