可遗传编码的、基于色氨酸的青色荧光氨基酸用于蛋白质光谱学和显微成像

《JACS Au》：Genetically Incorporable, Tryptophan-Based Cyan Fluorescent Amino Acid for Protein Spectroscopy and Microscopy

　　

6-乙酰基-L-色氨酸（6Ac-Trp）被合成作为色氨酸（Trp）类似物，其吸收光谱延伸至约400 nm，发射光谱跨越蓝到绿可见光区域。其荧光量子产率具有环境敏感性（即，在水中约0.54，在疏水溶剂中小于0.01）。研究人员进化出一种高活性的合成酶，用于在大肠杆菌（Escherichia coli）和哺乳动物细胞中位点特异性掺入6Ac-Trp。此外，通过双光子激发荧光显微镜（two-photon excitation fluorescence microscopy）成像，在活HeLa细胞中细胞穿透肽的分布以及在HEK293T细胞中组蛋白H3的核定位，证明了6Ac-Trp的实用性。鉴于其与色氨酸的结构相似性、与化学肽合成的兼容性以及遗传编码能力，6Ac-Trp为复杂生物系统中蛋白质动力学、相互作用和定位的位点特异性研究提供了一种有用的最小荧光团（minimal fluorophore）。

**论文解读：基于遗传编码的6-乙酰基色氨酸荧光探针及其在蛋白质光谱学和显微成像中的应用**

**研究背景与问题**

荧光技术，特别是荧光显微镜，是生物医学研究中不可或缺的工具，能够提供高信噪比的分子信息，如构象、相互作用、定位等。然而，大多数生物分子本身缺乏合适的荧光团，因此需要荧光标记。目前常用的荧光标记包括荧光蛋白和荧光染料，但它们各有局限：荧光蛋白通常只能引入目标蛋白（POI）的N端或C端等有限位点；荧光染料虽可通过化学连接掺入，但因其体积大或疏水性强，尤其在POI内部引入时容易导致显著的结构扰动。为克服这些限制，研究人员致力于开发与天然荧光氨基酸（如色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe）结构相似的荧光标记。色氨酸是最广泛使用的内源性荧光探针，但天然Trp的荧光特性（如紫外区发射、量子产率低）限制了其应用。已有研究开发了多种Trp衍生物，其中4-氰基色氨酸（4CN-Trp）表现出较好的光物理性质（可见光区发射、量子产率>0.8），但其最大激发波长约360 nm，限制了其在单光子和双光子激发荧光成像中的应用。因此，亟需开发具有更红移吸收光谱、同时保持强荧光的非天然氨基酸（ncAA），并能通过遗传编码实现位点特异性掺入，以最小结构扰动研究天然环境中的目标蛋白。

**研究内容与意义**

本研究报道了6-乙酰基-L-色氨酸（6Ac-Trp）的表征与遗传编码。该色氨酸衍生物具有独特的荧光性质：发射光谱覆盖蓝到绿可见光区，荧光量子产率（QY）对环境湿度高度敏感。研究人员首先通过化学合成获得6Ac-Trp，并验证其作为生物探针在追踪细胞穿透肽分布上的应用；随后进化出正交翻译系统，实现6Ac-Trp在细菌和哺乳动物细胞中的位点特异性掺入，并成功可视化组蛋白H3在哺乳动物细胞中的核定位。该研究发表于《JACS Au》，为复杂生物体系中的蛋白质动态、相互作用和定位研究提供了一种新型最小荧光团。

**关键技术方法**

研究人员采用的主要关键技术包括：（1）通过Sonogashira交叉偶联和金(I)催化的炔烃区域选择性水合反应，从6-溴-L-色氨酸出发经五步合成6Ac-Trp；（2）利用GFP琥珀抑制试验，以嵌合苯丙氨酸合成酶（chPheRS）为模板，经历向突变筛选得到高活性合成酶6AcWRS；（3）通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证6Ac-Trp掺入GFP和EcTyrRS的保真度；（4）采用双光子激发荧光显微镜（λex = 740 nm）对活HeLa细胞及固定HeLa细胞中的细胞穿透肽（CPP）和HEK293T细胞中的组蛋白H3进行成像。样本来源包括HeLa细胞和HEK293T细胞（购自ATCC），肽段通过固相化学合成获得。

**研究结果**

**1. 设计与合成6Ac-Trp**
基于前人研究，研究人员假设4-乙酰基-L-色氨酸（4Ac-Trp）和6Ac-Trp可能具有更好的光物理性质，选用乙酰基替代甲酰基以增强化学稳定性。通过五步反应成功合成6Ac-Trp，4Ac-Trp采用相同路线（未进行Boc脱保护和酯水解步骤）。

**2. 吸收与发射性质**
通过测量6Ac-Trp在多种溶剂（水、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈）中的吸收光谱、荧光光谱和量子产率，发现：其吸收光谱在>260 nm有两个峰，最长吸收波长在水相中达301 nm；荧光发射峰在470 nm（水中），呈现青色；量子产率对质子溶剂敏感（水中QY=0.54，疏水溶剂中<0.01）。与4CN-Trp相比，6Ac-Trp在340–400 nm范围内的摩尔消光系数和亮度显著更高（例如λex=355 nm时，亮度为2054 vs 593）。此外，短肽GW*G（Gly-Trp*-Gly）的光物理性质与游离6Ac-Trp类似，表明酰胺键无显著影响。

**3. 荧光衰减动力学与机制**
6Ac-Trp的荧光在所有溶剂中均呈双指数衰减，通过测量6-乙酰基吲哚（6AcI）的荧光衰减及量子力学计算（DFT和TD-DFT），发现其双指数衰减源于荧光团的内在性质，而非色氨酸的旋转异构体模型。计算表明6AcI存在三个低能激发态（S₁、S₂、S₃），其中S₁和S₃为亮态（π→π*，分子内电荷转移），S₂为暗态（n→π*）。通过动力学模型推导出微观速率常数，并确定S₂与S₁的平衡常数（K_eq=6.1，ΔG=?4.5 kJ/mol），证实S₂在热力学上可从S₁到达。

**4. 光谱学应用**
利用6Ac-Trp的环境敏感性，研究人员将其掺入穿透素（penetratin）的Trp6位点（突变肽称penetratin*），研究肽-膜相互作用。圆二色谱（CD）证实突变未改变肽的折叠性质。在POPC/POPG（6:4）小单层囊泡（SUV）存在下，penetratin*的荧光发射峰从470 nm蓝移至449 nm，强度下降52%，表明6Ac-Trp处于脱水或部分脱水环境，且比天然Trp对环境变化更敏感。在仅含中性脂质（POPC）的SUV中，荧光无明显变化，与穿透素仅与负电荷膜强相互作用的结论一致。此外，当使用295 nm激发时，Trp14的荧光被6Ac-Trp通过荧光共振能量转移（FRET）强烈淬灭。

**5. 遗传掺入6Ac-Trp**
通过GFP琥珀抑制试验筛选嵌合PheRS突变体，得到最活跃的突变体M2（Q356G/E391D/F464V/T467G/M490A/A507G），命名为6AcWRS。LC-MS验证了6Ac-Trp高保真掺入GFP和EcTyrRS。掺入6Ac-Trp的EcTyrRS（EcTyrRS-6Ac-Trp）在463 nm有特征荧光峰，比游离6Ac-Trp蓝移7 nm，表明处于部分水合环境。

**6. 活细胞中肽的成像应用**
将6Ac-Trp引入TAT、P16-NLS和P16三种细胞穿透肽的C端或Trp6位点，通过双光子激发荧光显微镜（λex=740 nm）成像活HeLa细胞。结果显示：TAT*和P16-NLS*分布于胞质和内涵体囊泡，P16-NLS*呈现更多点状信号；两者均未进入细胞核，提示以往报道的核定位可能为固定细胞的人工产物。P16*荧光强度较低，主要位于细胞膜，与文献一致。1 μM TAT*浓度下仍可检测到足够信号。

**7. 哺乳动物细胞中蛋白质的成像应用**
将6AcWRS/chPheT系统直接转入HEK293T细胞，利用mCherry-T2A-EGFP-D190TAG报告基因，流式细胞术证实6Ac-Trp可在哺乳动物细胞中成功掺入。随后选择组蛋白H3（H3）作为模型蛋白，构建H3-E105TAG-mCherry融合蛋白。在6Ac-Trp存在下，仅表达H3-E105TAG-mCherry的细胞在蓝色（6Ac-Trp）和红色（mCherry）通道均出现核内强荧光信号，且无背景掺入，证明6Ac-Trp可特异性标记目标蛋白并可视化其核定位。

**结论与讨论**

本研究成功开发并表征了6-乙酰基-L-色氨酸（6Ac-Trp）作为一种新型遗传编码荧光氨基酸，通过引入乙酰基到吲哚环6位，使其具有可见蓝绿发射（水中λem=470 nm）和高量子产率（QY=0.54）。与广泛使用的基于Trp的荧光ncAA 4-氰基色氨酸（4CN-Trp）相比，发射峰红移55 nm，在340–400 nm激发波长范围内的亮度提高3.5倍。此外，6Ac-Trp的荧光量子产率对局部水合度高度敏感，在疏水溶剂中几乎可忽略。研究人员利用这一环境敏感性探测肽-膜相互作用，成功监测了细胞穿透肽在膜结合和细胞定位时的局部脱水过程。研究人员还设计了一种高活性合成酶（6AcWRS），实现了该ncAA在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的位点特异性掺入，并通过可视化HEK293T细胞中组蛋白H3的核定位验证了该遗传编码平台。这些结果确立了6Ac-Trp作为介于小分子染料和荧光蛋白之间的强大最小荧光探针，为复杂生物系统中蛋白质动力学、相互作用和定位的研究提供了新机遇。