丰盈蛋白的靶向调控增强卵巢癌腹水的蛋白质组学分析：一项初步技术流程比较

《Journal of Proteome Research》：Targeted Modulation of Abundant Proteins Enhances Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Ascites: A Pilot Technical Workflow Comparison

　　

卵巢癌患者的腹水被越来越多地认为是癌症研究中有价值的生物流体，因为其蛋白质组成反映了疾病状态，并可能揭示治疗敏感性和反应的生物标志物。然而，高丰度蛋白质（如白蛋白）的存在阻碍了低丰度蛋白质的检测。在本研究中，研究人员评估了五种蛋白质制备方法在去除卵巢癌腹水中高丰度蛋白质或富集低丰度蛋白质方面的有效性。Norgen (Nor)、Minutes (Min) 和高氯酸 (PerCA) 方法基于高丰度蛋白质去除，而 Urine (Uri) 和 Nanomics (Nano) 试剂盒专注于低丰度蛋白质富集。处理后的样品使用无标记定量自下而上蛋白质组学通过 LC-MS/MS 进行分析，随后进行生物信息学评估。与未去除的腹水 (UnD) 相比，Min、Nor、Nano 和 PerCA 增加了蛋白质鉴定数量，而 Uri 产生的图谱与 UnD 相似。值得注意的是，PerCA 和 Nano 能够识别与癌症相关通路（包括免疫反应和自噬）相关的独特蛋白质亚群。PerCA 富集了跨膜和分泌型免疫调节糖蛋白，而 Nano 富集主要捕获了分泌型、核型和细胞质可溶性蛋白。总体而言，研究人员的结果表明，高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集都改善了腹水蛋白质组覆盖范围，每种方法在识别生物学相关的低丰度蛋白质方面都具有独特的优势。

卵巢癌是主要妇科恶性肿瘤，其腹水作为富含疾病信息的生物流体，蛋白质组成可反映疾病状态并揭示治疗敏感性生物标志物。然而，腹水中高丰度蛋白质（如白蛋白、免疫球蛋白）严重阻碍低丰度功能性蛋白质的检测，目前缺乏针对腹水的标准化去除或富集方法。为优化腹水蛋白质组学分析，研究人员评估了五种蛋白质制备方法（Nor、Min、PerCA、Uri、Nano）在卵巢癌腹水样本中的效果。样本来自一名卵巢癌患者的腹水，经六种处理（含未去除对照）后进行无标记定量自下而上LC-MS/MS蛋白质组学分析，结合生物信息学评估。主要技术方法包括：基于高丰度蛋白去除的Nor（离子交换）、Min（沉淀法）、PerCA（酸沉淀法），以及基于低丰度蛋白富集的Uri（尿液蛋白浓缩）和Nano（AI设计纳米颗粒蛋白冠捕获）。通过比较蛋白质鉴定数量、覆盖度、独特蛋白及通路富集，评估各方法性能，并利用抗体检测验证候选标志物。

**Identification and Quantitation of Proteins in Ascites Treated Using Different Protein Depletion or Enrichment Methods**
通过比较六组（每组三次技术重复）的蛋白质鉴定数量，发现Min（415个）、Nano（432个）、Nor（440个）和PerCA（416个）方法均提高了总蛋白数，而Uri（386个）与未去除腹水（UnD）相似。Nor展现出最高的蛋白质组恢复覆盖率（92.5%），PerCA的覆盖率最低（75.5%）但产生最多独特蛋白（40个，10.0%）。Nano方法在低分子量蛋白（<30 kDa）占比上与其他方法相当（约40%），但提高了高碱性蛋白（pI > 9）的检测。重复性评估显示Nor和Nano的中位CV值最低（6.64%和6.73%），而Min的CV值最高（10.86%）。主成分分析（PCA）和热图表明，Min、Nano和PerCA组产生独特的蛋白质图谱，而Uri与UnD高度相似。在免疫球蛋白（IgG）去除效率上，PerCA（10.58%）和Nano（16.67%）显著降低IgG比例，而Nor、Min和Uri效果有限。白蛋白（ALB）去除方面，PerCA和Min实现近乎完全去除，Nano部分去除，Uri效果最小。

**Unique Proteins and Related Pathways**
通过维恩图分析，PerCA和Nano分别鉴定出40个和13个独特蛋白。PerCA独特蛋白的Reactome通路分析显示其参与免疫反应、细胞因子信号、自噬和中性粒细胞脱颗粒等过程；蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络揭示LAMP1、LAMP2与VDAC1等自噬相关蛋白连接，以及细胞因子信号与适应性免疫系统蛋白簇。Nano独特蛋白主要为可溶性细胞质/核蛋白（如HMGB1、NCL）和分泌因子（如MDK、PF4），而PerCA独特蛋白富集跨膜和分泌型免疫调节糖蛋白（如ICAM3、CD74、IL1RAP、TNFRSF1B）及蛋白酶抑制剂（如WFDC2、SPINK1）。

**Potential Biomarkers Identified through Different Treatment Methods**
通过与533种癌症分泌蛋白（CSP）数据库比较，发现151种蛋白在所有方法中共享，且34种蛋白仅在去除后检测到。这些蛋白中，ICAM1、SOD1、IGFBP5、CDH13、IGFBP3和SPP1与膀胱癌强相关。PPI网络显示高交互枢纽蛋白（HSPA8、ICAM1、SPP1等）主要来自PerCA、Nano和Nor方法。抗体检测验证了ALDOA和CD44，其中ALDOA在Nor和Min处理后丰度增加，与MS结果一致，而CD44存在平台间差异，归因于肽段与抗体表位重叠程度。

**Cross-Comparison with Published Ovarian Ascites Proteome**
与三篇已发表卵巢癌腹水蛋白质组数据集比较，本研究鉴定出110种新蛋白，其中25种蛋白为恶性腹水特有（排除肝硬化或良性腹水），且17种仅在去除方法中检测到，强调了去除步骤对发现癌症相关生物标志物的必要性。

**讨论总结**
腹水蛋白质组分析受高丰度蛋白干扰，商业试剂盒均非专为腹水设计。不同机制（离子交换、沉淀、酸沉淀、纳米颗粒蛋白冠）导致不同蛋白质图谱。PerCA和Nano有效去除白蛋白和IgG，PerCA产生最多独特蛋白但覆盖度最低，适用于跨膜/分泌型免疫调节蛋白；Nano适用于可溶性细胞质/核蛋白；Nor和Nano在总蛋白鉴定和覆盖度上最优。Uri因保留大量白蛋白而不推荐用于腹水。研究局限性在于未分离细胞外囊泡（EVs），未来可结合超速离心等方法。

**结论翻译**
本研究证明，不同的蛋白质处理方法提高了低丰度蛋白质的检测，并对蛋白质组图谱的特异性产生不同影响。研究人员基于对卵巢癌腹水进行的无标记自下而上LC-MS/MS蛋白质组学研究得出这些结论，这些腹水经过五种不同蛋白质去除或富集方法处理，并与未去除样本进行比较。研究人员比较了它们的整体蛋白质组图谱、独特蛋白和癌症相关蛋白。这些方法依赖于不同的机制；因此，研究人员观察到其蛋白质组图谱的差异并不意外。研究人员还评估了它们去除典型高丰度蛋白（白蛋白和IgG）的效率。PerCA和Nano均被证明对去除白蛋白和IgG非常有效，从而提高了蛋白质鉴定。推荐这两种方法用于去除白蛋白和IgG。此外，在考虑独特蛋白时，PerCA方法鉴定出40个独特蛋白，而纳米试剂盒鉴定出13个独特蛋白。尽管鉴定出更多独特蛋白，PerCA方法显示出最低的蛋白质覆盖度。CSP数据库搜索和与已发表腹水数据的比较表明，关键潜在标志物来源于去除组，但随方法不同而异。因此，研究人员在将PerCA去除方法应用于其感兴趣的蛋白质时，应仔细平衡灵敏度和特异性。方法选择还应基于所研究的特定蛋白质类别。例如，关注跨膜和分泌型免疫调节糖蛋白的研究可能更适合Per方法，而分泌蛋白和可溶性细胞质或核蛋白的分析可能更兼容Nano方法。尽管如此，仍推荐在研究实验室的初步试验中使用PerCA去除。关于总蛋白鉴定和覆盖度，Nor和Nano试剂盒是前两种方法，因为它们全面覆盖中高丰度蛋白，同时还能检测腹水样本中的低丰度蛋白。本研究提供了一个实用、可适应的工作流程，用于可靠地富集和定量追踪腹水来源的生物标志物，支持卵巢癌监测，并使靶向蛋白质组学平台能够整合到常规临床实践中。