肠道微生物群产生具有心脏代谢益处的二亚硝基铁配合物（DNICs）

《Cell》：Gut microbiota generate dinitrosyl iron complexes with cardiometabolic benefits

　　

肠道细菌影响宿主生理，但其潜在机制尚未完全了解。研究人员鉴定出一条途径，即肠道微生物将无机硝酸盐和非血红素铁转化为可移动的、具有生物活性的二亚硝基铁配合物（DNICs），这些配合物被系统性分布并影响宿主代谢。电子顺磁共振（EPR）在常规小鼠的组织中检测到DNICs，但在无菌小鼠中未检测到。小鼠和人类粪便以及大肠杆菌（E. coli）从硝酸盐和柠檬酸铁中生成DNICs，而硝酸还原酶缺陷突变体则不能。膳食补充硝酸盐+柠檬酸铁或合成DNICs增加了组织DNIC水平，并改善了西方饮食喂养小鼠的心脏代谢功能障碍。此外，在HepG2细胞和人类肝细胞球体中，DNIC减少了脂肪酸诱导的脂肪变性。DNIC的生物活性由Fe(NO)₂实体介导，而不是由游离的一氧化氮（NO）介导，并涉及可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的激活、亮氨酸摄取的抑制以及mTORC1信号传导的正常化。调节肠道微生物群形成的DNIC可能是支持心脏代谢健康的一种策略。

**研究背景与问题**
肠道微生物群对宿主生理具有重要调节作用，但其机制尚未完全阐明。一氧化氮合酶（NOS）来源的信号对心血管代谢功能至关重要，但游离一氧化氮（NO）作为效应分子存在稳定性差、扩散受限等问题，而更稳定的物种如二亚硝基铁配合物（DNICs）可能发挥更重要的作用。然而，DNICs是否在健康体内组成性形成并发挥内分泌型调节作用尚不清楚。此前研究表明，膳食硝酸盐可被肠道细菌生物激活，产生未知的心脏代谢有益物种，但具体机制未知。本研究源于一个意外发现：常规小鼠组织中存在DNIC的电子顺磁共振（EPR）信号，而无菌小鼠中完全缺失，这提示DNICs可能并非由宿主NOS直接产生，而是依赖肠道微生物。因此，研究人员旨在探究肠道微生物在DNIC生成中的作用及其对心脏代谢健康的影响。

**关键技术与方法**
研究人员主要采用以下技术方法：使用X波段EPR（77K）检测组织、粪便和细菌中的DNIC信号；厌氧培养体系（37°C）评估小鼠和人类粪便及大肠杆菌（E. coli）野生型与硝酸还原酶（NR）缺陷突变体的DNIC生成能力；通过膳食补充硝酸盐（10 mM）和柠檬酸铁（5 mM）或合成DNIC-硫代硫酸盐（5 mM）干预心脏代谢疾病（CMD）小鼠模型（西方饮食+ L-NAME，8周，n=20/组）；肌动描记法（myograph）评估离体小鼠主动脉血管舒张反应；化学发光法检测气相NO释放；高分辨率呼吸仪测定线粒体复合体IV活性；FRET-based cGMP成像分析大鼠心肌细胞；Western blot检测肝脏mTORC1、S6K1、SREBP1、ACC磷酸化；油红O染色和Nile Red染色评估肝脂肪变性；L-[3H]-亮氨酸摄取实验评估亮氨酸转运；三维（3D）原代人肝细胞球体模型（来自三个捐赠者：BioIVT、KaLy-Cell、Lonza）评估DNIC抗脂肪变性作用。样本队列来源包括常规和无菌C57BL/6J小鼠（Janvier Labs及奥斯陆大学）、10名健康人类志愿者（4女6男，平均年龄46.4岁）。

**研究结果**
**1. DNICs存在于常规小鼠肝脏和肾脏中，但无菌小鼠中缺失**
EPR分析显示，常规小鼠肝脏和肾脏存在g=2.04的DNIC特征信号（约中nM水平），而无菌小鼠中完全检测不到，证实DNICs的组成性存在依赖于肠道细菌。

**2. 膳食硝酸盐和非血红素铁增加组织DNIC水平**
常规小鼠补充硝酸盐（10 mM）后肝脏DNIC水平显著升高，添加柠檬酸铁进一步增加；无菌小鼠即使补充硝酸盐也无DNIC生成，表明该过程依赖肠道微生物。

**3. 肠道微生物在体外从硝酸盐和非血红素铁生成DNIC**
小鼠和人类粪便厌氧培养于硝酸盐+铁中产生强DNIC信号，无菌粪便或无硝酸盐培养则无信号，且无性别差异。

**4. 细菌硝酸还原酶（NR）对DNIC生成至关重要**
大肠杆菌野生型（RK4353）在硝酸盐存在下生成DNIC，而缺失所有三种NR亚型的突变体（JCB20480）则不能，但加入亚硝酸盐并辅以谷胱甘肽（GSH）可暴露DNIC信号，提示NR还原硝酸盐为亚硝酸盐是关键步骤。

**5. NOS来源的硝酸盐在体内贡献于微生物依赖的基础DNIC生成**
广谱NOS抑制剂L-NAME处理5天显著降低肝脏DNIC水平，同时降低血浆硝酸盐和亚硝酸盐，表明NOS活性通过产生硝酸盐间接参与DNIC生成，无菌小鼠因缺乏细菌而无法形成DNIC。

**6. DNICs作为实体从肠道转运至组织**
使用膜不可渗透金属螯合剂MGD处理小鼠，肝脏和肾脏DNIC信号显著下降，但细胞内铁池不受影响；合成DNIC-硫代硫酸盐注入后，血液和肝脏中检测到蛋白结合DNIC，MGD将其转化为NO-Fe-MGD并出现在尿液中，证明DNIC以Fe(NO)₂实体形式转运而不解离为Fe和NO。

**7. DNIC通过Fe(NO)₂实体独立于游离NO刺激sGC-cGMP信号**
肌动描记法显示，DNIC-硫代硫酸盐诱导小鼠主动脉舒张（EC₅₀≈10 nM），该效应被sGC抑制剂ODQ完全阻断，但仅被NO清除剂cPTIO部分减弱，表明其主要依赖sGC-cGMP而非游离NO。大肠杆菌野生型上清液（含DNIC）同样诱导血管舒张，而NR突变体上清液无效。化学发光法检测不到DNIC释放NO，线粒体复合体IV活性不受DNIC抑制，FRET-cGMP分析显示DNIC增加心肌细胞cGMP水平，该效应被ODQ抑制但不被PTIO抑制，进一步证实Fe(NO)₂实体直接激活sGC。

**8. DNIC治疗对心脏代谢的有益效果**
在CMD小鼠模型中，8周DNIC-硫代硫酸盐或硝酸盐+铁干预使组织DNIC水平升高2-3个数量级，降低血压、减少脉冲压、减轻室间隔和后壁厚度，改善内皮依赖性舒张功能，并防止肥胖、高血糖、糖耐量异常、高胰岛素血症和高胆固醇血症，同时预防肝脂肪变性（油红O染色阳性面积显著减少）。

**9. DNICs限制肝脏mTORC1-SREBP1信号并激活ACC**
Western blot分析显示，CMD小鼠肝脏中mTORC1（Ser2448）、S6K1和SREBP1磷酸化增加，ACC磷酸化呈下降趋势；DNIC和硝酸盐+铁干预正常化这些标志物，促进脂肪酸氧化并抑制脂肪生成。

**10. DNICs抑制HepG2细胞中mTORC1-SREBP1信号和脂质积累：sGC和亮氨酸摄取的潜在作用**
在HepG2细胞中，游离脂肪酸（FFA）诱导脂质积累和mTORC1磷酸化，DNIC-硫代硫酸盐（10 μM）显著减少脂质，该效应被ODQ消除。在U373胶质母细胞瘤细胞中，DNIC浓度依赖性抑制L-[3H]-亮氨酸摄取，提示DNIC通过抑制LAT系统降低亮氨酸可用性，从而抑制mTORC1激活。

**11. DNICs通过抑制SREBP1信号减轻人类肝细胞球体脂肪变性**
在3D原代人肝细胞球体模型中，FFA处理10天导致显著脂肪变性，DNIC-硫代硫酸盐（1或10 μM，每日处理）显著减少脂质含量，并降低SREBP1及其下游靶标硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）的基因表达，效果在三个不同捐赠者中一致。

**讨论与结论**
本研究表明，表达硝酸还原酶（NR）的肠道细菌利用无机硝酸盐（来自NOS活性或膳食来源）和非血红素铁生成具有生物活性的DNICs，这些DNICs以蛋白结合形式系统性分布并积累于组织中。膳食补充硝酸盐+铁或合成DNIC-硫代硫酸盐显著增加组织DNIC水平，并在CMD小鼠模型中有效预防多种病理特征，包括肝脂肪变性。DNIC的直接抗脂肪变性作用也在HepG2细胞和原代人肝细胞球体中得到证实。机制上，DNIC的心脏代谢保护作用由Fe(NO)₂实体介导，靶向sGC-cGMP和LAT/亮氨酸通路，阻止mTORC1及其下游靶标（S6K1、SREBP1、SCD1）的过度激活。研究结论：研究人员发现，表达NR的肠道细菌利用无机硝酸盐（来自NOS活性或膳食来源）和非血红素铁生成具有生物活性的DNICs。膳食补充硝酸盐+铁显著增强细菌DNIC形成并促进其以蛋白结合形式系统性分布。这种以DNIC为中心的膳食方法通过激活sGC和抑制细胞亮氨酸摄取，防止mTORC1信号过度激活及其下游靶标，从而缓解CMD小鼠模型中心血管和代谢病理的进展，并减少人类肝细胞球体中FFA诱导的脂肪变性。硝酸盐与非血红素铁的组合与流行病学证据一致，这些化合物在植物性食物中丰富，与降低心血管疾病风险和肝脂肪变性相关。这些发现凸显了调节肠道来源生物活性代谢物作为新型治疗策略的潜力。