全组织光学透明化兔股薄肌用于评估肌梭形态学

《Frontiers in Neuroscience》：Whole-mount optical clearing of rabbit tenuissimus muscle for assessment of muscle spindle morphology

　　

肌梭是本体感觉的关键受体，为姿势、运动协调和反射控制提供感知基础。然而，它们位于肌肉深处且具有复杂的三维结构，历史上限制了形态学分析，只能依赖劳动密集型技术，如银浸渍、肌肉撕碎或连续切片后进行体积重建。在此，研究人员提出了一种全组织光学透明化和多重荧光成像工作流程，能够在兔股薄肌（一种富含肌梭的独特肌肉）中原位三维可视化肌梭。研究人员将梭外囊细胞、感觉和运动神经支配（包括由α-银环蛇毒素（α-BTX）标记的梭内γ神经肌肉接头）的荧光标记与基于溶剂的光学透明化相结合。通过共聚焦和光片成像，实现了对整个肌梭结构的稳健且可重复的成像。值得注意的是，研究人员改进了先前的方法，首次以与基于溶剂的光学透明化兼容的方式用α-BTX标记运动终板，从而能够在完整肌肉中同时可视化梭外神经肌肉接头和梭内运动终末。兔股薄肌表现出极高的肌梭密度（1,600 ± 217 个肌梭/克），促进了定量形态学分析，包括囊长度、体积、横截面积和梭内纤维数量。高分辨率体积成像还揭示了Ia环形螺旋末梢在其天然解剖背景下的复杂组织。这种可重复的工作流程克服了传统肌梭组织学的主要限制，并为研究肌梭发育、可塑性、衰老和病理学提供了一个强有力的平台。更广泛地说，它确立了兔股薄肌作为本体感觉器官结构研究的卓越模型。

**论文解读：全组织光学透明化兔股薄肌用于评估肌梭形态学**

**研究背景**
肌梭是骨骼肌中特化的感觉受体，通过传入纤维（Ia和II）检测肌肉长度变化并传递至中枢神经系统，参与本体感觉和肌张力反射控制。肌梭由梭内肌纤维（核袋和核链纤维）组成，其感觉末梢位于非收缩的赤道区，而γ运动神经元在γ神经肌肉接头处调节梭内纤维张力，从而改变感觉传入对牵张的响应。肌梭结构完整性和正常神经支配对运动控制、反射反应和适应性（如运动学习、姿势控制）至关重要。然而，肌梭位于肌肉深处，传统形态学分析依赖银浸渍、肌肉撕碎或连续切片后进行三维重建，这些方法劳动密集且难以完整保留其三维结构。近年来，组织透明化技术（如基于溶剂、水凝胶等方法）为原位成像提供了新途径，但此前存在关键障碍：荧光标记γ神经肌肉接头的主要试剂——荧光染料偶联的α-银环蛇毒素（α-BTX）与基于溶剂的光学透明化（如iDISCO）不兼容，导致无法同时可视化梭内γ运动终板和梭外神经肌肉接头。因此，本研究旨在开发一种可重复的工作流程，将α-BTX标记与溶剂型光学透明化结合，实现兔股薄肌中肌梭的完整三维可视化，并对其进行定量形态学分析。
**研究内容与结论**
研究人员开发了多重荧光标记和光学透明化工作流程，成功在兔股薄肌中原位成像肌梭的完整结构（包括囊、感觉和运动神经支配）。该工作流程具有100%的成功率（12块肌肉来自7只兔，两次独立制备），并实现了四重荧光标记（核、运动终板、神经支配和囊）。通过共聚焦和光片显微镜，研究人员获得了高分辨率体积图像，并定量分析了肌梭密度（平均1,600个肌梭/克）、梭内纤维数量（平均3.2根）、囊体积（平均1,086,415 μm3）、长度（平均591 μm）和最大横截面积（平均19,597 μm2）。该研究首次证明了α-BTX标记与iDISCO溶剂型光学透明化的兼容性，克服了传统方法的局限性，为研究肌梭发育、可塑性、衰老和病理提供了强有力平台。论文发表在《Frontiers in Neuroscience》。
**主要关键技术方法**
本研究采用的关键技术包括：荧光标记法（使用α-BTX-Alexa Fluor 647标记运动终板，免疫荧光标记神经丝（NF）和突触囊泡糖蛋白2（SV2）以显示感觉和运动神经支配，以及葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）标记梭外囊细胞）；基于溶剂的光学透明化流程（FDISCO，包括四氢呋喃脱水和二苄醚折射率匹配）；成像采用共聚焦显微镜和光片显微镜（MegaSPIM和Zeiss Lightsheet 7）。样本来源：新生新西兰白兔（P5-P14），共13只兔（3雄、7雌、3未知）的21块肌肉，来自5次独立透明化制备。
**研究结果**
**溶剂型光学透明化实现了荧光标记肌梭的可视化**
通过该流程，研究人员成功实现了肌梭的完整成像。光学透明化导致肌肉长度收缩约31.1%，但信号均匀保留。在兔股薄肌中，肌梭沿中线平行于神经血管束分布，平均每个肌肉含23.4个肌梭，密度约1,600个肌梭/克。GLUT1免疫荧光标记梭外囊细胞，NF和SV2标记感觉环形螺旋末梢，α-BTX标记运动终板（包括γ梭内和α梭外）。研究人员首次证明α-BTX标记与溶剂型透明化兼容，并可区分γ和α神经肌肉接头。四重荧光标记（加入PO-PRO-1碘化物核染）进一步揭示了梭内肌纤维的核袋和核链纤维。
**我们的工作流程实现了肌梭的形态学分析**
通过共聚焦和光片显微镜，研究人员对肌梭进行了定量形态学分析。共聚焦成像显示Ia环形螺旋末梢的复杂结构，并计数梭内纤维平均为3.2根。光片显微镜结合GLUT1分割，测量了肌梭囊的体积（平均约1,086,415 μm3）、长度（平均591 μm）和最大横截面积（平均19,597 μm2）。这些参数在不同肌梭间存在较大变异，但可重复获得。
**总结与讨论**
讨论部分指出，本工作流程的优势在于克服了传统肌梭组织学的主要限制，实现了完整肌肉中原位体积成像，且兼容标准四通道荧光显微镜。与先前研究相比，首次成功将α-BTX标记与iDISCO溶剂型透明化结合，无需静脉注射，简化了操作。兔股薄肌因其高肌梭密度（约1,600个肌梭/克）和薄型结构，特别适合肌梭形态学分析。新生兔模型的选择基于其与人类中枢神经系统发育的相似性及转化研究潜力。局限性包括溶剂型透明化导致的组织收缩（约31%），但一致的处理条件允许相对比较。
**研究结论**
本研究提出了一种新的工作流程，用于新生兔股薄肌中肌梭的荧光标记和体积成像。该肌肉因其高肌梭密度而特别适合肌梭形态学测量。这种新方法能够原位研究肌梭结构，包括囊、环形螺旋末梢和梭内神经肌肉接头，在健康和疾病背景下均适用。