综述：一天中的时间作为心血管和肾脏疾病研究中的生物学变量：来自美国心脏协会的科学声明

《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》：Time of Day as a Biological Variable in Cardiovascular and Kidney Disease Research: A Scientific Statement From the American Heart Association

　　

生活方式行为如饮食、体力活动和睡眠在心脏代谢疾病的每个阶段都发挥着重要作用。这些行为遵循人类的日常昼夜节律（circadian rhythms）。这些内源性生物节律由存在于身体每个细胞中的自主分子钟（molecular clock）控制。这呈现了一种转化错配（translational mismatch），其中临床人类程序通常是在清醒、活跃、进食状态下的个体中进行，而实验室啮齿动物程序往往在白天它们的不活跃休息期进行，此时它们几乎没有进食动机。这份美国心脏协会（American Heart Association）科学声明旨在提高认识，即一天中的时间是一个生物学变量，必须被视为从基础到临床科学的所有生物医学研究中的关键调节因素。心血管和肾脏系统的整体功能以昼夜节律方式运作，使得一天中的时间在理解基础和临床研究中至关重要。这种日常变异性从基因表达（gene expression）到功能输出以及介于两者之间的一切。在这里，研究人员提供了为什么需要在研究实验设计和解释的各个方面考虑一天中的时间的理由，并提供了研究人员认为有助于加强心脏代谢和肾脏研究的严谨性和实用性的有用建议。

**STATEMENT OF THE PROBLEM**：美国心脏协会（American Heart Association, AHA）的使命是成为更长寿、更健康世界的不懈力量。基础生物医学研究人员通过执行临床前研究来揭示驱动心血管疾病的机制，从而成为这一使命的核心。这些机制见解最终导致改善心脏代谢疾病的预防策略、疗法、康复方法和生物标志物。生活方式因素如饮食、体力活动和睡眠通过影响心脏代谢健康下的分子通路，在心脏代谢疾病的每个阶段（从预防到恢复）都发挥着重要作用。重要的是，这些行为本身遵循日常节律：人类在白天的清醒状态下更活跃并消耗大部分热量，而在夜间睡眠和禁食。相比之下，临床前研究的主要实验模型——实验室小鼠和大鼠——是夜间活动的。它们在夜间最活跃并消耗大部分食物，白天休息且进食极少。这产生了一种转化错配：临床人类程序通常是在清醒、活跃、进食状态下的个体中进行（除非需要禁食），而实验室啮齿动物程序往往在白天它们的不活跃休息期进行，此时它们几乎没有进食动机。如果分子和生理过程在24小时内恒定，这可能无关紧要，但昼夜节律研究显示相反：几乎所有分子通路、代谢功能、生理过程和心脏代谢健康读数在白天和黑夜之间波动。Hoogerwerf¹的引文为在实验方法中考虑一天中的时间提供了有力论据，尤其是在临床前领域：最后，应鼓励研究人员根据光-暗周期定义实验的实际时间。毕竟，人们只能猜测一个几乎完全基于刚被唤醒的餐后小鼠的工作构建的生物数据库意味着什么。这些发现通过考虑生活方式因素相对于实验程序的时间，以及探索基于时间的诊断和预后如何减轻心脏代谢疾病负担，为改善严谨性和可重复性开辟了新途径。心血管功能，如同几乎所有生理过程，表现出昼夜节律（约24小时），与心脏健康直接相关。例如，在未经治疗的患者中，心肌梗死的发生在上午9点比晚上11点频繁3倍²。健康人的血压（blood pressure, BP）在下午晚些时候达到峰值，夜间休息时下降，醒来时再次上升，尽管精确时间因人而异，取决于个体的时间类型（chronotype）。这种节律的临床意义被数十年的流行病学证据所强调，这些证据表明，正常夜间血压下降（dipping）的丧失与不良心血管结果密切相关。这些动态直接影响了血压监测：不同时间点读取的读数可能产生不同的轮廓。它们还影响了关于调整降压治疗（不仅药物选择和剂量，还有时间）以符合个体血压模式的讨论。这些例子突出了研究心脏代谢功能日变化机制以及从昼夜节律生物学角度解释实验数据的重要性。与人类一样，实验室啮齿动物在生理和代谢方面表现出强大的昼夜节律。然而，由于它们是夜间活动的，这些节律的相位通常相对于日间活动的人类是倒置的。这使得测试时间成为评估啮齿动物模型中与人类相关干预措施的关键变量。同样重要的是要认识到，培养中的细胞可以被同步化，从而能够表现出并维持内在节律^3,4。通常，培养中的细胞需要刺激来诱导同步化，但并非所有细胞类型都容易同步化，尽管核心时钟基因表达完整。在分子水平上，昼夜节律由存在于几乎所有细胞中的细胞时钟驱动。在最基本的层面上，这些时钟由转录调节因子组成，它们以约24小时的自动调节转录-翻译反馈环（transcription-translation feedback loop, TTFL）运作：BMAL1及其伙伴CLOCK（或NPAS2）结合到Cryptochrome（CRY1, CRY2）和Period（PER1-3）基因启动子中的E-box元件，激活它们的转录（图1）⁵。翻译后的PER和CRY蛋白形成异二聚体，转位到细胞核，抑制BMAL1/CLOCK活性，从而抑制自身转录。PER/CRY的降解解除这种抑制，启动下一个BMAL1/CLOCK介导的转录周期。在一个互锁环中，核激素受体RORs和Rev-Erbs作为Bmal1的激活子和抑制子，也通过其启动子区域的E-box元件受核心时钟的反馈调节。这些核心时钟组件在哺乳动物中保守，并在预期的时间驱动大量非昼夜节律基因（包括其他转录和转录后调节因子）的节律性表达，跨越白天和黑夜周期。这种相互作用，连同组织特异性因素，导致在许多组织中多达约30%的表达蛋白编码基因出现每日振荡⁶，并通过蛋白质稳定性、定位和修饰的翻译后调控产生额外的节律性层次。因此，广泛的细胞和生理功能表现出每日节律，使得实验时间成为心脏代谢研究中的关键因素。内源性昼夜节律为生物体提供了将其内部生理与外部环境同步化的能力。对于人类，这对应于光周期中的活动和食物摄入以及暗周期中的睡眠。对于实验室啮齿动物，这对应于暗周期中的活动和食物摄入以及光周期中的睡眠。人类和啮齿动物在休息和活动周期之间表现出显著差异。与不活动周期相比，在活动周期中，人类和啮齿动物表现出更高的肾功能、更强的心血管效率、更高的体温和更快的反应时间。在细胞水平上，线粒体功能在活动期高于不活动期，而DNA修复在不活动期高于活动期。当今行性的人类在白天（此时啮齿动物处于不活动期）研究实验室啮齿动物时，这种错配就变得有问题。

**SCOPE OF THE STATEMENT**：地球上的生命已经进化，使得大多数生物过程以约24小时的节律运作，以预测与白天可预测且重复的环境变化相关的需求。底层昼夜节律调节系统的发现是由昼夜节律领域的先驱者（尤其是Pittendrigh⁷和Aschoff⁸）数十年前开创的。最终，对时钟在控制人类健康中关键作用的认可，由2017年诺贝尔奖颁发给果蝇核心昼夜节律时钟基因的发现⁹而得到确认，随后这些基因在几乎所有生物体（包括人类）中被识别。这份美国心脏协会科学声明旨在提高认识，即一天中的时间是一个生物学变量，必须被视为所有生物医学研究（从基础到临床科学）中的关键调节因素。在许多方面，这与考虑性别作为生物学变量类似。性别需要根据研究目标以及是否有理由怀疑性别特异性效应来考虑。每个器官系统都因细胞自主时钟（由时钟基因驱动）与行为和环境因素（如光、体力活动、食物摄入和睡眠）之间的相互作用而节律性地运作。这导致许多功能输出全天不断变化，范围从基因表达到血压控制。事实上，大量调节基因在全天以不同速率转录。诸如CircaDB¹⁰和CircaAge¹¹等数据库提供了来自一系列组织和模型生物的跨越两个昼夜周期的基因表达数据，为昼夜节律和非昼夜节律生物学家提供了关键资源，以考虑一天中的时间作为关键生物学变量。细胞和器官功能在白天和黑夜之间变化，这使得在临床或实验室中测量时认识到一天中的时间至关重要。每个细胞和器官系统中的节律在一天中的特定时间达到峰值和谷值，这些时间与环境和行为对齐以优化其功能。当这些系统受到挑战（例如，在夜间进行体力活动或进食）时，会导致错配，从而可能增加心血管和其他疾病风险¹²。有大量证据表明，诸如轮班工作等行为会大大增加心血管和肾脏疾病的风险¹²。目前，研究人员对导致生理系统错配后果的基本机制了解相对较少。请读者参考Knutson及其同事¹³最近关于维持昼夜节律对于促进心脏代谢健康重要性的美国心脏协会科学声明。他们的科学声明提供了昼夜节律生物学如何对心脏代谢健康重要的清晰理由，描述了环境和行为因素如何导致健康风险，并提供了抵消这些影响的关键要点。相比之下，本科学声明强调了一个更基本的点，即提供了在生物医学研究的更广泛背景下将一天中的时间视为生物学变量的重要性的理由。

**CENTRAL COMPARED WITH PERIPHERAL CLOCKS**：如前所述，身体中的每个细胞都包含一个以约24小时间隔循环的转录-翻译反馈环（TTFL）昼夜节律时钟机制^10,14,15。TTFL的精确时间由称为授时因子（zeitgebers）或“时间给予者”的输入信号决定，这些信号用于将这些时钟与环境和行为信号同步化，这个过程定义为夹带（entrainment）。中央时钟位于下丘脑的视交叉上核（suprachiasmatic nucleus），通过视神经接收直接的光输入，这进而向其他脑区（特别是对心血管控制重要的下丘脑区域）发出信号，这些区域对于与外围组织通信至关重要。存在于所有器官系统中的外围时钟通常由源自中央时钟的神经和内分泌输出调节。然而，根据器官系统的不同，其他授时因子如食物摄入、体力活动和睡眠也在调节基因表达和功能输出中发挥重要作用。尽管TTFL以细胞自主方式运作，但授时因子对于保持这些时钟与环境对齐至关重要。行为和环境因素可以触发器官特异性功能的变化，这些变化与TTFL控制的输出时间不匹配，并可能导致健康风险增加^16,17。一个简单的例子是，将小鼠的慢性食物限制在通常消耗较少食物的典型休息期（开灯）会导致肾纤维化和血管僵硬¹⁸。相反，诸如限时进食（time-restricted feeding）等策略已被用于使功能输出与时钟节律对齐，以改善代谢并降低疾病风险。

**UNDERSTANDING CLINICAL RELEVANCE OF CIRCADIAN RESEARCH**：本节包含多个子标题，包括行为贡献、疾病风险等。**Behaviors Contributing to Circadian-Dependent Health Risk**：人类流行病学和受控实验室研究表明，昼夜节律紊乱（circadian disruption）与心脏代谢健康受损存在病因学关联¹⁹。昼夜节律紊乱通常源于授时因子（如光和进餐）暴露时间的不规律。在自然环境中，中央时钟由阳光夹带。在不适当时使用人造光，包括夜间使用发光屏幕，会导致昼夜节律紊乱²⁰。类似地，在不适当时（如生物夜间）进餐会扰乱某些器官和组织（如胰腺、肝脏、肠道、心脏）中的外围时钟，并导致内部不同步²¹。不适时的授时因子暴露也会扰乱睡眠，从而导致心脏代谢健康受损^22,23。当人类在夜间暴露于这些授时因子时，昼夜节律和睡眠紊乱更为常见。夜间或轮班工作涉及夜间清醒，会导致在生物夜间暴露于光和进餐²⁴。这可能导致昼夜节律不同步和睡眠障碍。时差（jet lag）源于跨越时区，是昼夜节律和睡眠紊乱的另一个常见原因²⁵。时差导致身体内部时钟与每日光/暗周期之间的错配。时差还可能导致不规律的睡眠时间，从而改变光暴露。实际上，工作日与休息日之间睡眠时间的巨大差异被称为社交时差（social jet lag）²⁶。最后，一些睡眠障碍如失眠与昼夜节律紊乱有关²⁷。鉴于昼夜节律紊乱与心脏代谢健康之间的联系，减轻昼夜节律紊乱对于睡眠和心脏代谢结果具有临床重要性。**Disease Risk Contributing to Circadian Disruption**：包括高血压、代谢疾病、慢性肾脏病等。**Hypertension**：正常情况下，血压遵循昼夜节律（diurnal rhythm）：在清醒期最高，在睡眠期降至最低（即血压下降，BP dipping）²⁸。24小时期间的血压时间过程可通过动态血压监测（ambulatory BP monitoring）或较不常见的特殊家庭血压监测设备（在清醒和睡眠期间预设时间点测量，通常超过一个24小时周期）来评估^29,30。在动态血压监测中，个体可分为非下降血压状态（nondipping BP status，定义为睡眠期至清醒期收缩压比>0.90）或下降血压状态（dipping status，比≤0.90）³¹。一项荟萃分析显示，与下降血压状态相比，非下降血压状态在包括平均24小时血压的调整模型中与心血管结局风险增加相关（相对风险2.05 [95% CI, 1.00–4.20]）³²。由于一些个体的睡眠期血压相对于清醒期血压有过度升高或下降，下降状态还可分为4类：极度下降模式（睡眠期至清醒期收缩压比≤0.80）、下降模式（0.80-0.90）、非下降模式（0.90-1.00）和反向下降模式（>1.00）。在西班牙59,124名初级保健患者中，非下降模式和反向下降模式与全因死亡率（非下降模式风险比1.13 [95% CI, 1.06–1.20]；反向下降模式风险比1.41 [95% CI, 1.32–1.51]）和心血管死亡率（非下降模式风险比1.20 [95% CI, 1.14–1.27]；反向下降模式风险比1.49 [95% CI, 1.38–1.60]）的风险增加相关，在包括平均24小时血压的调整模型中³³。最后，从睡眠到清醒过渡期间的血压升高称为早晨血压激增（morning BP surge）²⁸。一项荟萃分析中，更大的早晨血压激增（定义为早晨收缩压与最低睡眠收缩压之差）与全因死亡率风险增加相关（相对风险1.29 [95% CI, 1.11–1.52]）³⁴。**Metabolic Disease**：由于昼夜节律振荡器存在于所有细胞中，昼夜节律时钟可以被视为一个时钟网络而非单个时钟。这些时钟需要协调或同步以维持日常生物功能的最佳调节，尤其是在代谢功能方面。光是中央时钟的主要夹带因子或授时因子，中央时钟接收来自视网膜中专门光感受器的直接输入³⁵。长期以来人们认为外围时钟不能自行夹带。然而，开创性工作表明，在热量限制进食下，定时进餐能够引发预期活动反应（食物预期活动），这种反应在持续光照条件和视交叉上核损伤啮齿动物中持续存在³⁶。在21世纪初，先驱分析表明，限制性进食能够夹带肝脏时钟而不影响中央时钟³⁷，首次证明（1）外围时钟可以通过不依赖光的线索直接夹带，以及（2）内部时钟可能彼此不同步。振荡器之间的不同步导致每日节律衰减，并与大量疾病和衰老相关³⁸。在21世纪初，对肝脏中一天内时间序列基因表达的分析突显了代谢途径中显著的昼夜节律，这些节律与肝脏在营养处理和解毒中白天/黑夜的划分一致。不久之后，与肝脏在维持代谢健康中的关键作用一致，时钟缺陷小鼠被证明具有失调的葡萄糖稳态^39-41。后来的研究揭示了各种昼夜节律突变小鼠中广泛的代谢改变，包括失调的体重、脂质和葡萄糖稳态^42-46。在人类中，时钟基因中的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms）据报道与对各种疾病（如睡眠、精神疾病和代谢紊乱）的易感性增加相关（由Janoski等⁴⁷综述）。具体而言，全基因组关联研究（genome-wide association studies）揭示了肥胖和空腹高血糖与时钟基因变异之间的关联⁴⁸。时钟基因突变可能罕见，并非大多数人群经历的昼夜节律紊乱的主要原因。使内部时钟时间与外部行为错位的慢性生活方式条件暴露会导致大多数个体出现昼夜节律时钟紊乱。这些生活方式因素包括在不适当的昼夜节律时间进食、睡眠或运动。另一个可能扰乱昼夜节律的重要生活方式因素是慢性应激⁴⁹。源于广泛原因的慢性应激在现代社会很常见，与昼夜节律紊乱和心血管疾病风险密切相关。各种社会心理应激类型与应激反应既定机制之间的具体相互作用已在别处综述^12,50-53。总体而言，重要的是认识到神经内分泌系统如下丘脑-垂体-肾上腺轴、皮质醇和自主神经系统都以昼夜节律方式运作。皮质醇失调，通过抑制或不适当升高或不同步，对代谢有广泛影响。感知压力和负面情绪，包括愤怒、敌意、抑郁、精力衰竭和创伤后应激障碍症状，与血压下降减少或睡眠期血压升高相关^50,54-56。这些发现广泛表明感知压力和负面情绪与昼夜节律紊乱相关。所有这些昼夜节律紊乱的来源在经历显著昼夜节律紊乱的轮班工人中很常见⁵⁷。轮班工作与心血管疾病、女性生殖障碍和癌症以及代谢疾病的风险升高相关^58,59。靶向昼夜节律时钟可能降低此类风险。药理学方法仍然有限，只有少数小分子尚未被美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration）批准直接靶向时钟⁶⁰。除了药理学，生活方式改变可以增强时钟功能并改善代谢疾病结果^61,62。例如，通过限时进食强制执行每日进食节律可保护免受饮食和年龄相关的时钟功能衰减，导致雄性和雌性小鼠（即使在老年和时钟突变小鼠中）的多重健康益处^63-68（由Gallop等⁶⁹综述）。在人类中，限时进食改善了轮班工人的代谢健康⁷⁰。**Chronic Kidney Disease**：肾功能，包括肾小球滤过率和液体-电解质排泄，遵循主要由转录-翻译反馈环（TTFL）调节的强昼夜节律。肾功能节律抵抗外部操作，如通过光、睡眠和食物摄入产生的强制不同步，这导致环境因素与生理节律之间的错配^71-73。流行病学研究表明，长期破坏性行为如轮班工作与慢性肾脏病风险增加之间存在强关联^74,75。其他风险行为如光暴露和社交时差作为人类慢性肾脏病的贡献因素尚未得到充分研究。然而，越来越多的临床前研究证明了在慢性昼夜节律紊乱模型中高血压、肾脏和血管疾病风险增加。这些包括慢性白天食物限制、光暴露定期改变的时差模型以及高脂饮食暴露^18,76,77。已充分确定慢性肾脏病本身与血压、肾功能和睡眠/清醒模式的昼夜节律紊乱强烈相关^78,79。尽管干扰外部时间线索可以触发肾脏中广泛的致病机制，但一天中的时间是一个贡献因素这一点不容忽视。例如，在睡眠呼吸暂停小鼠模型中，肾脏中大量基因的节律性表达已被证明被破坏⁸⁰。通过敲除整个肾单位中的BMAL1来破坏分子时钟会导致基因表达和蛋白质丰度的24小时节律发生广泛变化⁸¹。因此，使用肾脏组织进行多组学测量时，一天中的时间显然是一个被广泛忽视的变量。**Relationship Between the Molecular Clock and Human Disease States**：几个分子昼夜节律时钟基因，包括BMAL1、PER和CRY，已被认为与心脏代谢疾病风险相关。希腊一项对185名妊娠期糖尿病女性和161名对照的病例对照研究表明，BMAL1基因的rs7950226 (G>A)和rs11022775 (T>C)多态性以及rs7950226G/rs11022775C和rs7950226A/rs11022775C单倍型与妊娠期糖尿病相关⁸²。一项来自两个旁遮普队列（一个来自英国，一个来自巴基斯坦）的1732名2型糖尿病个体和1780名对照的更大病例对照研究显示，PER2附近的rs7602358G等位基因对糖尿病易感性有保护作用，而BMAL1 rs11022775T等位基因与糖尿病风险增加相关⁸³。这些关联在与其他南亚人群（SAT2D [South Asian Type 2 Diabetes Consortium]）和欧洲白人队列（DIAGRAM+ [Diabetes Genetics Replication and Meta-Analysis]）的汇总数据荟萃分析中未得到确认。该荟萃分析确实提示了CRY2 rs2292912和CRY1 rs12315175与2型糖尿病的可能关联。英国一项基于家庭的连锁关联研究中，在来自424个有2型糖尿病患者的家庭的1304名个体中，在纠正多重检验的模型中，所研究的BMAL1单核苷酸多态性均未与高血压或糖尿病相关⁸⁴。然而，一个3标志物BMAL1单倍型（rs6486121-rs3789327-rs969485）与高血压的关联最强，而一个2标志物单倍型（rs7950226-rs11022775）与糖尿病相关。这些发现表明BMAL1多态性对心脏代谢风险的综合效应。有限数据表明时钟基因也与心肌梗死（CLOCK和ARNTL）和卒中（CLOCK）的风险相关^85,86。**Translational Utility of Using Nocturnal Animals for Preclinical Research Including Circadian Disruption Models**：小鼠是夜间活动的，而人类是日间活动的（图2）。这使研究结果的解释复杂化，尤其是在将内部昼夜节律相位与时钟时间、行为状态（活动/睡眠）和环境线索（如光、进食和运动）对齐方面，这些都与患者护理相关。尽管如此，临床前啮齿动物模型对于推进昼夜节律生物学和指导治疗至关重要。原因在于，尽管啮齿动物和人类的光周期相位相反，但活动/进食和休息/禁食相关的功能节律在细胞和器官系统水平上得以维持。在心血管研究中，它们提供了研究心脏病理生理学的强大平台。例如，冠状动脉结扎模型模拟了伴有或不伴有再灌注的心肌梗死，反映了及时和延迟的临床护理⁸⁷。昼夜节律研究在重症监护室等环境中尤其有价值，因为那里的节律被人造光扰乱⁸⁸。在小鼠中，模拟心肌梗死后的这种紊乱会损害心脏重塑并恶化结果，由炎症、内皮功能障碍和代谢失调驱动⁸⁹。节律紊乱还会改变调节肌联蛋白和收缩性的通路^90,91。尽管存在行为差异，但这些模型在机制和预测方面具有价值。遗传和环境错配模型揭示了更多见解。τ突变仓鼠具有缩短的22小时昼夜节律周期，发展为心肌病和肾脏疾病⁹²。在压力超负荷模型中，光/暗错配会恶化高血压、肥大和血管功能⁹³。这些发现与强调转化潜力的人类实验室和流行病学研究一致^23,94,95。总之，这些临床前模型强化了维持昼夜节律对齐的重要性，并表明靶向授时因子如光、睡眠/活动或进餐时间可能提供低风险、临床可行的益处。主要心血管及相关疾病，包括睡眠呼吸暂停、致心律失常性病症和射血分数保留或降低的心力衰竭，也可能受益于昼夜节律对齐的护理^96-100。啮齿动物模型进一步为时间治疗学（chronotherapy）提供了信息^14,101。血小板活性和冠状动脉功能的时间差异支持夜间阿司匹林¹⁰²或白天硝酸甘油¹⁰³等方法。时间治疗学可能有益于高血压管理和心脏重塑¹⁰⁴，尤其可能针对特定患者群体，如轮班工人或非下降性高血压个体¹⁴。此外，几项研究已证明，当在晚上而非早晨服用他汀类药物时，低密度脂蛋白胆固醇显著降低^105,106。主动脉瓣手术的时间¹⁰⁵或靶向昼夜节律调节通路的药物给药时间^101,107也具有改善结果的潜力。底线是，尽管在夜间活动啮齿动物中的昼夜节律研究需要仔细转化，但它们提供了关于生物时间如何影响心血管健康的重要见解，并为改善患者护理开辟了新机会。

**PROPER EXPERIMENTAL DESIGN AND REPORTING**：**Considerations for Rigor and Reproducibility**：知道分子、细胞和系统范围的功能遵循昼夜节律，我们可以问，有多少次冲突结果可归因于测量和研究在不同时间进行但未如此报告？此外，测量通常在大白日（对于大多数大鼠和小鼠品系是睡眠/不活动期）进行，对应于休息生理状态和禁食代谢活动。我们不知道有多少次因在“错误”时间测量而被误导。在设计研究时，严谨的方法是在提供最有用的信息的时间获取数据（稍后进一步讨论）。出版物需要透明地报告测量的时间。例如，许多动物和人类研究经常在孤立血管中或通过流量介导的扩张等方法测量内皮功能。几项研究已证明，乙酰胆碱诱导的血管舒张水平根据一天中的时间而变化^77,108。在基金申请中，考虑一天中的时间作为生物学变量有充分的科学理由。**Choosing the “Right” Time for Procedures and Tissue Collections**：生物标志物是可测量的指标，可从体液或组织中收集。它们最常用于测量生物过程、状况或疾病¹⁰⁹。选择最佳时间收集生物标志物对于有效的生物标志物分析至关重要。昼夜节律调节基因表达、蛋白质水平和各种生理功能。不考虑昼夜节律时间收集生物标志物样本可能导致数据误解，特别是在评估动态生物标志物时¹¹⁰。例如，BNP（脑钠肽）和肌钙蛋白（troponin）是心血管疾病的关键蛋白质生物标志物^111,112，而胱抑素C（cystatin C）常用于慢性肾脏病¹¹³。这些蛋白质可能因昼夜节律对其表达和清除的调节而表现出时间变化。一致的收集时间对于跨个体和研究的比较至关重要。mRNA和蛋白质表达之间的差异也受收集时间的影响。通常，mRNA水平通常在其相应蛋白质之前达到峰值，因为翻译和翻译后蛋白质加工需要时间，因此仅测量mRNA（例如通过定量聚合酶链反应或RNA测序）可能无法准确反映功能性蛋白质丰度，可能导致误导性临床解释¹¹⁴。对于昼夜节律基因和蛋白质，这一一般概念更为复杂，因为诸如剪接和蛋白质降解等翻译后过程也受昼夜节律调节。事实上，节律性RNA和节律性蛋白质之间的重叠较低¹¹⁵。昼夜节律基因表达数据库是描述mRNA表达处于最大值或最小值的时间段的好资源，以便做出明智的决定，确定哪个时间最适合一致观察。对于代谢基因，禁食对基因表达的峰值和相位有额外的大影响，系统控制收集前的食物摄入是一个重要考虑因素。底线是，将样本收集与昼夜节律时间对齐可增强生物标志物数据的可靠性并提高可重复性。识别时间模式可确保诊断和研究结果真正反映疾病状态，而非昼夜节律波动。图3描绘了一个决策树，为如何在研究设计中考虑一天中的时间提供指导。**Transparency in Reporting and Publications and Regulatory Concerns**：尽管没有人质疑通过基因组学、蛋白质组学或任何分析技术生成大量数据的新方法的巨大价值，但必须考虑其局限性。它们包括在单一时间点进行测量。至少，研究人员建议期刊要求作者报告用于分析的标本的采集时间。也就是说，将一天中的时间作为重要变量的实验设计将给出最有意义的结果。几乎所有负责控制心血管和肾脏系统的神经内分泌因子都具有功能节律⁷²。为什么不想在最佳时间研究这些功能以最好地回答科学问题？此外，许多研究已表明，对刺激的生理反应通常因一天中的时间而异¹⁴。新研究定期发表，显示来自夜间活动动物（主要是啮齿动物）的组学数据，样本是在动物的生物夜间（休息期）采集的，此时心血管和肾功能与睡眠时间对齐且处于最低水平。然而，大多数人类活检和功能测量是在生物白天（活动期）进行的，与峰值活动和表现时间对齐。这种时间差异可能导致从动物到人类研究的转化问题，并可能已经导致不一致的发现。有限数量的采用组学方法（包括单细胞RNA测序）的研究实际上使用了来自不同时间点的样本¹¹⁶。这些数据提供了宝贵的资源，并导致了至少两个有用的数据库，CircaDB¹⁰和CircaAge¹¹，研究人员可以使用。

**KNOWLEDGE GAPS, ROADBLOCKS, AND FUTURE DIRECTIONS**：**Gaps in Current Understanding**：生物医学研究的总体目标是通过诊断、预防、治疗和康复方面的进步，将生物学见解转化为改善人类健康结果。昼夜节律生物学有可能影响所有这些方面，特别是在慢性、多因素疾病如心脏代谢和肾脏疾病中。与急性疾病不同，这些慢性疾病经历数年演变，需要纵向监测、多方面的治疗方案和长期恢复期。昼夜节律的优化和破坏都可以显著改变这些疾病轨迹。当前昼夜节律科学中的一个关键限制是，在受控实验室环境中测量的昼夜节律身体时间（circadian body time）与现实世界条件下如何表现之间的差距。人类中昼夜节律相位最公认的生物标志物是暗光褪黑素起始（dim-light melatonin onset），需要严格控制