水牛HspBP1基因的计算机表征以鉴定与静默发情行为相关的单核苷酸多态性

《Frontiers in Ecology and Evolution》：In-silico characterization of HspBP1 gene for identification of SNPs associated with silent estrus behavior in buffalo

　　

水牛静默发情行为是巴基斯坦乳制品行业可持续发展的巨大挑战。为了解决繁殖失败问题，在配种时选择具有良好发情迹象的动物至关重要。本研究分析了热休克结合蛋白1（HspBP1），以鉴定可能干扰发情迹象正常表达的单核苷酸多态性（SNPs）。从ENSEMBL数据库中检索了该基因的编码序列（CDS）和25个SNPs。研究人员手动构建了突变CDS，将SNPs整合到野生型基因中，并通过CELLO、Expasy ProtParam、PHYRE2.2、SWISS-MODEL、HDOCK工具和GROMACS进行分析。分析显示，SNPs HspBP1E56^*、HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1C129X和HspBP1V202X将突变蛋白的定位改变至细胞外和细胞核。变异HspBP1E317^*将蛋白定位改变至线粒体。这些SNPs赋予蛋白质更大的碱性、更低的热稳定性和体外稳定性，并导致截短结构。HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1E56^*、HspBP1A50D和HspBP1L13Q与HSP70复合物的对接得分比野生型HspBP1-HSP70复合物更负，表明预测的结合亲和力低于野生型。这表明所选变异可能干扰或改变HspBP1与HSP70之间的相互作用。基于主成分分析（PCA）、回转半径（Rg）、均方根偏差（RMSD）和自由能景观（FEL）数据的分子动力学（MD）模拟分析表明，三个SNPs（HspBP1V88G、HspBP1C94^*和HspBP1C129X）具有动态破坏性影响，而HspBP1V202X变异具有中等影响。本研究中鉴定的变异，经过基因型-表型关联研究验证后，可能有助于水牛繁殖增强和该国牲畜监测。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
巴基斯坦乳制品行业年产牛奶超过6000万吨，但水牛（*Bubalus bubalis*）普遍存在静默发情行为，即发情迹象微弱或缺失，导致人工授精时机难以把握，造成繁殖失败和生产力损失。静默发情受营养、内分泌、热应激、季节、光照、年龄、体重、生产水平和饲养条件等多重环境因素影响。为应对这一多因素限制，需同时考虑环境因素和遗传基础。HspBP1（热休克结合蛋白1）作为HSP70（热休克70 kDa蛋白）的辅助伴侣，通过结合HSP70的N端ATP酶结构域调节其活性，进而影响雌激素信号通路和发情表现。正常条件下，HspBP1与HSP70的适当结合确保雌激素受体正常释放，维持雌激素浓度，促进发情表现。若HspBP1结构被破坏，其与HSP70的亲和力降低，导致HSP70过度激活，干扰雌激素生成细胞，最终引发静默发情。由于水牛基因组存在数百万个单核苷酸多态性（SNPs），通过体内或体外实验逐一评估每个SNPs的生物学影响在逻辑和财力上不可行，因此本研究采用计算机模拟方法筛选HspBP1基因中可能对发情表现产生有害影响的SNPs，为后续实验验证提供候选变异。

**研究目的**
本研究旨在通过计算机模拟（in-silico）分析，从水牛HspBP1基因的25个SNPs中筛选出可能干扰发情迹象正常表达的变异，并预测其理化性质、结构、定位及与HSP70的相互作用，为静默发情相关的标记辅助选择提供初始候选。

**关键技术方法**
研究人员使用了以下主要生物信息学工具：
- 从ENSEMBL数据库（https://www.ensembl.org）获取水牛HspBP1基因的编码序列（CDS）及25个SNPs。由于缺乏官方注释的水牛HspBP1记录，选用牛（*Bos taurus*）的同源转录本（ENSBTAT00000004752.6），因二者基因组相似性达95%–98%。
- CELLO（cello.life.nctu.edu.tw）预测野生型及突变蛋白的亚细胞定位。
- Expasy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）计算理化参数，包括分子量、等电点（pI）、消光系数、不稳定指数、脂肪族指数和亲水性平均值（GRAVY）。
- PHYRE2.2（https://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）预测二级结构（α螺旋、β折叠、无序区域）。
- SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）进行同源建模，预测三维结构。
- HDOCK（hdock.phys.hust.edu.cn）进行分子对接，评估突变蛋白与HSP70（NP_976067.3）的结合亲和力。
- GROMACS（https://www.gromacs.org）进行分子动力学（MD）模拟，对5个变异（HspBP1E56^*、HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1C129X、HspBP1V202X）执行100 ns模拟，基于OPLS4力场、SPC水模型、0.15M NaCl，温度300K、压力1 atm，分析RMSD、RMSF、Rg、PCA和FEL。

**研究结果**
**3.1 SNPs对突变蛋白亚细胞定位的影响**
通过CELLO分析，野生型HspBP1蛋白主要定位于细胞质（得分1.761），其次为细胞外和细胞核。HspBP1E56^*和HspBP1C94^*将定位改变至仅细胞核；HspBP1V88G、HspBP1C129X和HspBP1V202X将定位改变至细胞外和细胞核；HspBP1E317^*将定位显著改变至细胞核和线粒体。其余变异未改变定位。

**3.2 SNPs对突变蛋白理化属性的影响**
ProtParam分析显示，HspBP1E317^*、HspBP1C129X和HspBP1E56^*导致pI大幅升高（分别达12.25、8.40和6.50），表明蛋白质碱性增强。HspBP1V88G、HspBP1C94^*和HspBP1C129X的脂肪族指数显著降低（42.15、45.27、43.58），提示热稳定性下降。这些变异的不稳定指数升高（96.72、95.90、88.33等），表明体外稳定性降低。截短变异（如HspBP1E56^*、HspBP1V88G等）的分子量和氨基酸数目明显减少。

**3.3 SNPs对突变蛋白二级结构的影响**
PHYRE2.2预测野生型蛋白含59% α螺旋、36%无序区域、0% β折叠。HspBP1E56^*、HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1E317^*和HspBP1V202X的α螺旋比例下降（22%–44%），无序区域比例上升（41%–82%），表明结构紊乱。

**3.4 SNPs对突变蛋白三维结构的影响**
SWISS-MODEL同源建模显示，HspBP1E56^*、HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1C129X和HspBP1V202X的三维结构发生显著改变，其余变异仅引起轻微变化。所有蛋白均为单体。

**3.5 SNPs对HspBP1与HSP70结合亲和力的影响**
HDOCK对接以野生型复合物得分（-274.63）为参照。HspBP1V88G（-205.67）、HspBP1C94^*（-208.36）、HspBP1E56^*（-216.01）、HspBP1A50D（-221.67）和HspBP1L13Q（-237.82）的对接得分较野生型增加（即更不负面），表明预测结合亲和力降低，可能干扰HspBP1与HSP70的正常调控相互作用。

**3.6 分子动力学模拟**
对HspBP1E56^*、HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1C129X和HspBP1V202X进行100 ns MD模拟，每个变异重复三次。分析显示：HspBP1E56^*因早期截短导致结构显著压缩，RMSD偏差大，Rg随时间减小，PCA显示构象异质性。HspBP1V88G表现出显著的动态不稳定性和构象异质性，存在多个亚稳态能量盆地。HspBP1C94^*同样结构不稳定，RMSD模式多样，Rg显示膨胀与压缩状态交替，FEL存在多个能量盆地。HspBP1C129X具有最高的构象可塑性，PCA空间分离大，RMSD和Rg差异显著，FEL多个能量盆地，表明动态破坏性最强。HspBP1V202X表现出中等构象变化，RMSD变异较小，Rg显示适度结构可塑性，PCA和FEL显示较为有序的构象亚态，破坏性相对较低。

**讨论与结论**
讨论部分指出，HspBP1变异与牛热耐受性相关，而水牛繁殖激素因高温-湿度指数（THI）升高而受干扰，导致静默发情。本研究鉴定的SNPs可能通过改变理化性质、定位、结构和动力学，影响HspBP1对HSP70的调控，从而与静默发情相关。部分截短变异可能通过无义介导的mRNA衰变（NMD）被降解，但若NMD逃避机制存在，则可能积累有毒截短蛋白。对接结果强调，HspBP1与HSP70结合亲和力的改变（无论增强或减弱）均可能破坏正常伴侣循环，而本研究中结合亲和力降低的变异（HspBP1V88G、HspBP1C94^*等）尤其值得关注。MD模拟进一步证实了HspBP1V88G、HspBP1C94^*和HspBP1C129X具有显著动态破坏性，而HspBP1V202X影响中等。结论部分翻译如下：
**结论**：计算机模拟方法为变异优先排序提供了平台，可将数百万变异缩小至少数最具破坏性的候选。本研究筛选出HspBP1基因中可能改变理化特性、定位、结构、动态及与HSP70相互作用的变异。比较对接分析显示，HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1E56^*、HspBP1A50D和HspBP1L13Q的预测结合亲和力低于野生型HspBP1-HSP70复合物，可能破坏正常伴侣调控相互作用。其他变异，包括HspBP1E56^*、HspBP1V88G、HspBP1C94^*、HspBP1C129X、HspBP1V202X和HspBP1E317^*，表现出显著的预测理化或结构变化。因此，这些SNPs被建议作为静默发情相关研究的初始计算机候选，可进入实验室进行物理测试。本研究将有助于设计高度靶向的实验研究，通过基因型/表型关联研究和实验功能分析，进一步验证SNPs作为人工选择生物标志物。该论文发表在《Frontiers in Ecology and Evolution》。