非羟肟酸基喹啉类似物作为HDAC8抑制剂的探索

《RSC Advances》：Exploration of non-hydroxamate based quinoline analogues as HDAC8 inhibitorsOpen Access

　　

组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）因其在表观遗传调控中的作用而成为有前景的治疗靶点。在本研究中，研究人员设计并探索了新型非羟肟酸基喹啉类似物作为HDAC8选择性抑制剂，这些抑制剂表现出纳摩尔级别的HDAC8酶抑制活性。值得注意的是，化合物BHC-10和BHC-13分别显示出30和42 nM的活性。对活性低于500 nM的化合物进行了体外细胞活性评估，其中两个化合物BHC-2和BHC-10在神经母细胞瘤细胞系（IMR-32和SH-SY5Y）中显示出有前景的活性。基于酶学分析和细胞分析，选择化合物BHC-2、BHC-10和BHC-13进行进一步评估，包括克隆形成实验、凋亡实验和细胞周期分析。克隆形成实验显示集落形成显著且剂量依赖性减少。流式细胞术分析表明凋亡细胞群体剂量依赖性增加，并诱导细胞周期阻滞于S期。机制研究通过Western blot分析证实了靶点参与，表现为SMC3乙酰化增强。此外，分子对接分析揭示了这些化合物与HDAC8蛋白的结合相互作用。本工作中的两个化合物BHC-10和BHC-13比参考化合物B更有效且更具选择性。总之，当前研究结果确定这些化合物是有前景的HDAC8调节剂，具有神经母细胞瘤治疗开发的潜力。

**论文解读：非羟肟酸基喹啉类似物作为HDAC8抑制剂的探索**

**研究背景**
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族通过催化组蛋白和非组蛋白的去乙酰化，在基因表达调控中发挥关键作用，其异常表达与多种癌症（如神经母细胞瘤）的发生发展密切相关。其中，HDAC8作为I类HDAC，在神经母细胞瘤等肿瘤中过表达，促进肿瘤细胞存活和增殖，成为有前景的治疗靶点。然而，现有HDAC抑制剂多为羟肟酸类，虽在临床中显示疗效，但存在代谢稳定性差、副作用和选择性不高等问题，限制了其应用。因此，开发非羟肟酸基的选择性HDAC8抑制剂具有重要价值。

**研究内容与结论**
研究人员基于前期工作，以α-氨基酰胺为锌结合基团（ZBG），通过改变喹啉环的氮位置和取代基，设计并合成了26个新型非羟肟酸基喹啉类似物（BHC-1至BHC-26）。通过酶活性筛选，发现8个化合物对HDAC8的IC₅₀低于500 nM，其中BHC-10和BHC-13活性最强（IC₅₀分别为30 nM和42 nM），且对HDAC4、HDAC1、HDAC3、HDAC6、HDAC10、HDAC11等异酶具有高选择性。进一步在神经母细胞瘤细胞系（IMR-32和SH-SY5Y）中评估抗增殖活性，BHC-2和BHC-10表现出显著活性（IC₅₀约10-15 μM），且对正常细胞HEK293T毒性较低。基于酶活和细胞活性，选择BHC-2、BHC-10和BHC-13进行深入研究。克隆形成实验显示，三者在IMR-32细胞中剂量依赖性抑制集落形成（BHC-13抑制率最高达63%）。流式细胞术表明，三者诱导细胞凋亡（Annexin V/PI阳性细胞增加51.7%-63%）并激活Caspase 3/7活性（最高2.44倍），同时诱导细胞周期阻滞于S期。Western blot分析证实，三者处理可增加HDAC8底物SMC3的乙酰化水平，而总SMC3蛋白水平不变，表明靶点参与。分子对接和分子动力学模拟（100 ns）揭示了BHC-2、BHC-10和BHC-13与HDAC8活性位点的结合模式，其中BHC-13与His148、His180、Phe208等残基形成稳定相互作用，与生物活性一致。结论：BHC-10和BHC-13比参考化合物B更有效且更具选择性，这些化合物是有前景的HDAC8调节剂，具有神经母细胞瘤治疗开发的潜力。论文发表在《RSC Advances》。

**主要关键技术方法**
- 基于结构的合理药物设计：通过改变喹啉环氮位置和取代基，优化与HDAC8表面区域的相互作用。
- 分子对接与分子动力学模拟：使用Glide XP模块进行对接（PDB: 3SFH），MM-GBSA计算结合自由能，Desmond进行100 ns分子动力学模拟以评估稳定性。
- 酶活性测定：荧光法测定HDAC8及异酶抑制活性，底物为Boc-Lys(trifluoroacetyl)-7-amino-4-methylcoumarin。
- 细胞实验：WST-1法测定抗增殖IC₅₀、克隆形成实验、Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡、Caspase 3/7活性测定、PI染色流式细胞术分析细胞周期。
- 靶点验证：Western blot检测SMC3乙酰化水平。
样本来源：人神经母细胞瘤细胞系IMR-32和SH-SY5Y、咽鳞癌细胞FaDu、人胚肾细胞HEK293T。

**研究结果**
**4. HDAC8抑制与异酶选择性**：通过酶活性筛选，26个化合物中8个对HDAC8的IC₅₀低于500 nM，BHC-10和BHC-13活性最强（30和42 nM）。选择性分析显示，这些化合物对HDAC4、HDAC1、HDAC6、HDAC10、HDAC11均无显著活性（IC₅₀ >35 μM或>35 μM），但对HDAC3有中等抑制（IC₅₀ 1.9-6.9 μM），总体表现出高HDAC8选择性。结构-活性关系（SAR）表明，单氯取代（3-Cl）和R1为氢时活性最佳，双氯或大体积基团削弱活性。

**5. 代表性化合物的体外抗增殖作用**：在IMR-32、SH-SY5Y、FaDu和HEK293T细胞中通过WST-1法测定，BHC-2和BHC-10在神经母细胞瘤细胞中表现出较强抗增殖活性（IC₅₀约10-15 μM），且对正常细胞HEK293T毒性较低（IC₅₀ 47-56 μM）。BHC-13的细胞活性较弱（IC₅₀约38-40 μM），但基于酶活性仍被选入后续研究。

**6. 对接分析**：分子对接显示BHC-2、BHC-10和BHC-13与HDAC8活性位点残基（如His142、Trp141、His180、Gly305等）形成氢键、π-堆积和水介导的相互作用。MM-GBSA结合自由能分别为-92.59、-82.80和-52.66 kcal mol^-1。分子动力学模拟（100 ns）表明，BHC-13复合物最为稳定（RMSD 3.6-5.0 ?），主要贡献残基为His148、His180、Phe208；BHC-10次之（RMSD 1.0-4.0 ?），主要贡献残基为Trp141、His142、His180；BHC-2稳定性稍差（RMSD 1.5-9.0 ?），但结合模式与生物活性一致。

**7. 集落形成实验**：在IMR-32细胞中，BHC-2（6和12 μM）分别减少集落形成36%和50%；BHC-10（8和16 μM）减少约40%和51%；BHC-13（20和40 μM）减少约53%和63%，均呈剂量依赖性。

**8. BHC-2、BHC-10和BHC-13诱导细胞凋亡的作用**：Annexin V/PI染色显示，BHC-2（12 μM）、BHC-10（16 μM）和BHC-13（40 μM）分别诱导51.7%、63%和57%的细胞凋亡。Caspase 3/7活性测定表明，三者均剂量依赖性激活Caspase，BHC-2（6和12 μM）分别增加1.51倍和2.18倍；BHC-10（8和16 μM）增加1.62倍和2.04倍；BHC-13（20和40 μM）增加1.66倍和2.44倍。

**9. 对细胞周期阻滞的作用**：流式细胞术分析显示，BHC-2（12 μM）、BHC-10（16 μM）和BHC-13（40 μM）处理24 h后，IMR-32细胞S期比例显著增加，G1和G2/M期比例相应减少，表明诱导S期阻滞。

**10. Western blot分析**：BHC-2、BHC-10和BHC-13处理IMR-32细胞后，乙酰化SMC3（Ac-SMC3）水平呈剂量依赖性升高，而总SMC3蛋白水平不变，证实HDAC8抑制导致底物乙酰化积累，支持靶点参与。

**讨论与结论**
讨论部分指出，虽然三化合物表现出强效抗癌活性并增加SMC3乙酰化，但乙酰化SMC3的积累作为HDAC8抑制的药效学标志，与生化数据一致，支持HDAC8为主要靶点。然而，不能排除其他分子靶点的可能性，未来需通过细胞热转变分析（CETSA）、亲和力靶点鉴定和蛋白质组选择性分析等方法进一步验证。结论部分翻译：研究人员设计并合成了一系列喹啉衍生物作为HDAC8抑制剂，其中BHC-10和BHC-13表现出低于100 nM的显著HDAC8抑制活性。BHC-2和BHC-10在神经母细胞瘤细胞系中表现出显著抗癌活性。对BHC-2、BHC-10和BHC-13的进一步评估揭示了这些化合物在神经母细胞瘤细胞系中的治疗潜力。这些非羟肟酸基抑制剂在治疗HDAC8高表达癌症方面具有广阔前景。基于对接和动力学洞察的持续结构优化可增强其效力，并促进未来癌症治疗先导化合物的开发。