聚(甲基丙烯酸海藻糖酯)增强固定化Alcalase在硅胶微球上的性能

《Sustainable Food Technology》：Poly(trehalose methacrylate) enhances immobilized Alcalase performance on silica microparticlesOpen Access

　　

聚(甲基丙烯酸海藻糖酯)功能化硅胶微球[SMP-g-p(TreMA)]通过表面引发的电子转移活化原子转移自由基聚合(SI-AGET-ATRP)合成，用作Alcalase固定化和稳定化的载体。研究人员用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)对Alcalase进行巯基化，并通过硫醇-马来酰亚胺交联固定到SMP-g-p(TreMA)上，用于牛血红蛋白(BHb)的水解增值。含有10%理论p(TreMA)表面功能化的硅胶微球[SMP-g10-p(TreMA)]与未修饰的氨基化硅胶微球[SMP–NH₂]相比，巯基化Alcalase的固定化效率提高了82.1%，且显著增强了固定化Alcalase的比活性（U mg_Alcalase^?1高2.2倍，U g_particle^?1高4.0倍），同时在温度及pH范围内保持了与未修饰Alcalase相似的性能。在60°C下，巯基化Alcalase的热稳定性显著下降（半衰期降低40%），但固定化后恢复了Alcalase-SH的热稳定性损失。尽管固定化于SMP-g10-p(TreMA)上的Alcalase表现出更高的整体活性，但聚(甲基丙烯酸海藻糖酯)表面功能化并未影响固定化Alcalase-SH的热稳定性。固定化Alcalase-SH可回收并重复使用6个循环，同时保持活性（6个循环后约1 U g_particle^?1），且硅胶微球上的聚(甲基丙烯酸海藻糖酯)在前4个循环中使性能相对于未修饰的氨基化硅胶微球提升至少2倍，之后表现相似。总体而言，硅胶微球的聚(甲基丙烯酸海藻糖酯)修饰是增强固体载体上固定化酶性能以实现生物加工应用的有前景的方法。

**论文解读：聚(甲基丙烯酸海藻糖酯)修饰硅胶微球增强固定化Alcalase性能的研究**

**研究背景与问题**
食品加工副产物（如动物血液）的酶法转化是减少食物损失、实现可持续发展的关键策略，但蛋白酶（如Alcalase）的热稳定性差、回收和重复使用困难限制了其工业化应用。传统固定化方法虽能提高酶的可重复使用性，但酶活性常因非特异性交联、构象改变或扩散限制而下降。海藻糖作为天然蛋白质稳定剂，可通过玻璃化、水置换等机制保护酶免受热、干燥等变性条件影响，但将其直接接枝于固体固定化载体表面以增强酶性能的研究尚属空白。本研究旨在通过表面引发聚合将聚(甲基丙烯酸海藻糖酯) [p(TreMA)] 接枝于硅胶微球表面，构建稳定化载体，用于Alcalase的固定化与稳定化，以实现牛血红蛋白（BHb）的高效水解增值。

**主要技术方法**
研究人员首先合成海藻糖甲基丙烯酸酯单体（TreMA），通过表面引发的电子转移活化原子转移自由基聚合（SI-AGET-ATRP）在氨基化硅胶微球（SMP–NH₂）上实现低（10%理论覆盖）和高（50%理论覆盖）两种程度的p(TreMA)接枝，得到SMP-g10-p(TreMA)和SMP-g50-p(TreMA)。利用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）对Alcalase进行巯基化修饰，引入硫醇基团（Alcalase-SH）。通过异双功能交联剂NHS–PEG₂–马来酰亚胺将Alcalase-SH共价固定于未修饰或p(TreMA)修饰的硅胶微球表面。通过ATR-FTIR、TGA、XPS对载体进行表征，采用Bradford法测定固定化量，以热变性BHb为底物测定酶活性，评估温度/pH曲线、60°C热稳定性及6个循环的重复使用性。

**研究结果**
**3.1 聚(甲基丙烯酸海藻糖酯)修饰硅胶微球的合成与表征**
通过ATR-FTIR、TGA和XPS证实，SI-AGET-ATRP成功将p(TreMA)接枝于硅胶微球表面，低水平修饰（SMP-g10-p(TreMA)）和高水平修饰（SMP-g50-p(TreMA)）的有机含量分别增加3.59%和11.16%，XPS显示碳含量和羰基信号显著上升，溴含量下降，表明p(TreMA)层覆盖了表面。

**3.2 Alcalase巯基化及其在p(TreMA)修饰硅胶微球上的固定化**
SATA修饰后Alcalase-SH获得约1.0–1.5个硫醇基团每分子，活性降低31.1%。固定化实验表明，SMP-g10-p(TreMA)获得最佳固定化量（~18 mg_Alcalase g_particle^?1，固定化效率29.7%），比SMP–NH₂（~10 mg_Alcalase g_particle^?1）高82.1%。固定化于SMP-g10-p(TreMA)的Alcalase-SH比活性（U mg_Alcalase^?1）是SMP–NH₂的2.2倍，单位颗粒活性（U g_particle^?1）是4.0倍，表明p(TreMA)微环境减少了酶-载体相互作用的变性效应。

**3.3 固定化Alcalase的温度与pH曲线**
温度曲线显示，未修饰和固定化Alcalase最适温度均为60°C。巯基化后Alcalase-SH在70°C和80°C的相对活性显著降低（50%和4% vs. 82%和21%），但固定化于SMP-g10-p(TreMA)后恢复至69%和20%，接近天然Alcalase，表明p(TreMA)微环境缓解了巯基化引起的热失稳。pH曲线显示所有形式最适pH为10.0，固定化后尤其在pH 9.0时相对活性提高（64% vs. 39%和33%），归因于共价固定化对酶构象的刚性化。

**3.4 固定化Alcalase的热稳定性**
在60°C、10 mM EDTA存在下，Alcalase-SH半衰期（t_1/2=3.6 min）比未修饰Alcalase（t_1/2=6.0 min）降低40%。固定化于SMP–NH₂或SMP-g10-p(TreMA)后，半衰期恢复至6.2 min（提高72%），但p(TreMA)未进一步改善热稳定性，提示固定化主要通过刚性化而非海藻糖微环境增强热稳定性。然而，固定化于SMP-g10-p(TreMA)的Alcalase-SH在60°C孵育1小时后仍保持较高绝对活性（1.56 U g_particle^?1 vs. 0.53 U g_particle^?1）。

**3.5 固定化Alcalase的重复使用性**
以合成底物N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸4-硝基苯酯（NPA）评估6个循环（60°C）。SMP-g10-p(TreMA)-Alcalase在前4个循环中比活性是SMP–NH₂-Alcalase的2倍以上，且活性下降更缓慢（从13.1 U g_particle^?1降至约1 U g_particle^?1），而SMP–NH₂-Alcalase首次使用后活性骤降80%。p(TreMA)微环境可能促进Alcalase-SH的再折叠并抑制自溶。

**结论与讨论**
本研究成功合成了p(TreMA)修饰硅胶微球，并证明10%理论覆盖的SMP-g10-p(TreMA)在固定化量、比活性、热稳定性恢复及重复使用性方面均优于未修饰载体。虽然p(TreMA)未显著影响固定化酶的热衰减速率，但其通过维持更高绝对活性提升了整体性能。EDTA的使用大幅降低了Alcalase热稳定性，提示未来应探索替代固定化策略（如多点共价固定或金属离子亲和吸附）。结论部分指出：固定化于SMP-g10-p(TreMA)上的Alcalase-SH增强了热稳定性和可重复使用性，可用于蛋白质食品副产物的增值转化；p(TreMA)表面修饰是提升固体载体上固定化酶性能的有效方法。