《Journal of Functional Foods》：Identification and screening of ACE-inhibitory peptides from
Camellia oleifera seed protein hydrolysates: Integrating
in silico predictions with
in vitro validation
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在本研究中，研究人员探究了用于水解油茶籽蛋白（CP）的最佳酶，使用了包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和胰蛋白酶在内的多种蛋白酶。碱性蛋白酶水解6小时后获得的水解物表现出最高的血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性，达到57.94% ± 1.58%。通过超滤、
在本研究中，研究人员探究了用于水解油茶籽蛋白（CP）的最佳酶，使用了包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和胰蛋白酶在内的多种蛋白酶。碱性蛋白酶水解6小时后获得的水解物表现出最高的血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性，达到57.94% ± 1.58%。通过超滤、Sephadex G-15凝胶色谱、LC-MS/MS分析和计算机模拟筛选，鉴定出两种肽——EFWDSR和FWDSQ。经固相合成后，两种肽均表现出ACE抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）分别记录为0.114 mg/mL和0.238 mg/mL。动力学分析表明，EFWDSR是非竞争性抑制剂，而FWDSQ是混合竞争性抑制剂。二级结构分析表明，EFWDSR主要由β-折叠和α-螺旋结构组成，缺乏β-转角或无规卷曲。相反，FWDSQ主要由β-折叠和无规卷曲结构组成，含有少量β-转角且无α-螺旋。分子对接研究表明，这两种肽均与ACE形成氢键。稳定性测试表明，EFWDSR在中性pH条件下4至70 °C之间结构稳定，而FWDSQ在中性和弱酸环境下的4至50 °C之间稳定。在体外模拟胃肠道消化过程中，两种肽均保持其稳定性。这些结果表明，来源于油茶籽的EFWDSR和FWDSQ作为功能食品成分或抗高血压剂具有潜在的应用价值。
高血压是以收缩压或舒张压持续升高为特征的疾病，是冠状动脉疾病、缺血性卒中和肾动脉硬化等多种心血管和脑血管并发症的主要可改变危险因素。血管紧张素转化酶（ACE，一种肾素-血管紧张素系统中的关键二肽基羧肽酶）介导无活性的血管紧张素I（Ang I）转化为强效血管收缩剂血管紧张素II（Ang II），直接导致外周血管阻力增加和血压升高。尽管合成的ACE抑制剂（如卡托普利）在控制血压方面表现出显著的临床疗效，但它们常伴有味觉障碍、持续性咳嗽、皮疹和血管性水肿等不良反应，可能降低患者的依从性和生活质量。相比之下，食源性生物活性肽因其环保生产、无累积代谢、低毒性和可生物降解性而成为可持续的替代品。油茶是全球四大木本油料作物之一。油茶籽饼作为榨油的副产品，约占种子总产量的50%，含有15-21%的蛋白质，是极具潜力的植物蛋白替代来源。然而，目前对油茶副产品的利用仍很有限，多用于燃料、有机肥和动物饲料等低价值应用，导致这一蛋白质资源未被充分利用。尽管已有研究表明水解后的油茶籽蛋白（CP）具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖和降压等多种生物活性，但关于来源于油茶籽饼的ACE抑制肽的研究仍然稀缺，尤其是在系统分离、结构表征和构效关系分析方面。为了填补这一空白，研究人员开展了这项研究，旨在通过结合计算机模拟预测与体外验证，从油茶籽蛋白中发现更多ACE抑制功能肽，并探索其抑制机制。本论文发表在《Journal of Functional Foods》上，对油茶籽蛋白的高价值利用和抗高血压功能食品的开发具有重要意义。
研究人员从中国浙江省衢州市购买了野生油茶籽作为实验样本，制备脱脂脱皂苷的油茶籽粕并提取CP。随后使用不同蛋白酶水解CP，通过pH-stat法测定水解度（DH），并进行ACE抑制率测定。采用超滤和Sephadex G-15凝胶过滤色谱对高活性组分进行分离纯化。利用Easy-nLC-MS/MS进行肽段序列鉴定，并通过BIOPEP数据库、PeptideRanker、ToxinPred、admetSAR和SwissTargetPrediction等生物信息学工具进行计算机模拟筛选。随后通过固相合成多肽，并进行抑制动力学分析、傅里叶变换红外光谱（FTIR，一种用于分析分子化学键和官能团的光谱技术）分析、分子对接以及体外胃肠道消化和温度/pH稳定性测试，以评估其活性和稳定性。
CPH的制备、超滤和Sephadex G-15凝胶色谱
通过对比不同蛋白酶的水解效果，发现碱性蛋白酶水解6小时后获得的产物具有最高的ACE抑制活性（57.94% ± 1.58%）和最高的DH。研究指出，碱性蛋白酶是一种丝氨酸内肽酶，优先裂解疏水氨基酸残基附近的肽键，从而产生低分子量的肽，这与其较高的活性有关。超滤分离得到四个组分（CPH1-4），其中分子量（MW，物质的分子质量）小于3 kDa的CPH1表现出最高的抑制活性（72.33%），这表明较低分子量的肽通常具有更强的ACE抑制活性。对CPH1进行Sephadex G-15色谱纯化后得到两个主峰F1和F2，其中F1具有更高的ACE抑制活性，遂用于后续序列鉴定。
F1多肽的鉴定与计算机模拟筛选
通过LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱技术）共鉴定出2390种肽段，这些肽段长度在4到23个氨基酸之间，其中含有4到6个残基的肽占多数。基于从头测序评分大于98和结合能小于-8.0 kcal/mol的标准，筛选出EFWDSR、FWDSQ和LRLL三种肽。这三种肽具有低分子量和良好的亲水性，有利于肠道吸收。固相合成后的验证表明，EFWDSR和FWDSQ表现出ACE抑制活性，其半数抑制浓度（IC50，能抑制50%活性的浓度）分别为0.114 mg/mL和0.238 mg/mL，而LRLL无活性。
EFWDSR和FWDSQ的抑制模式
通过Lineweaver-Burk双倒数作图分析，EFWDSR表现为非竞争性抑制剂，而FWDSQ表现为混合型抑制。
傅里叶变换红外光谱分析
FTIR分析表明，EFWDSR由70.85%的β-折叠和29.15%的α-螺旋组成，没有无规卷曲或β-转角，结构高度刚性；而FWDSQ含有43.31%的无规卷曲、42.30%的β-折叠和14.39%的β-转角，无α-螺旋，表现出更为灵活和无序的状态。
肽EFWDSR和FWDSQ与ACE的分子对接模拟
分子对接研究表明，EFWDSR和FWDSQ与ACE的结合能分别为-11.626 kcal/mol和-11.097 kcal/mol。EFWDSR与ACE形成了7个氢键，而FWDSQ形成了5个氢键，这与EFWDSR更强的ACE抑制活性相一致。
EFWDSR和FWDSQ的稳定性
在热稳定性和pH稳定性方面，EFWDSR在4至70 °C及中性pH条件下结构稳定；而FWDSQ在4至50 °C及中性或弱酸环境中保持稳定。在体外模拟胃肠道消化实验中，经胃蛋白酶消化后两种肽的活性均无明显变化；随后的胰蛋白酶消化使FWDSQ的活性显著下降，但仍保留了80%以上的残余活性，表明两者均具有强消化稳定性。
在本研究中，研究人员利用LC-MS/MS技术鉴定了来源于CPH的两种新型ACE抑制肽，分别称为EFWDSR和FWDSQ。这两种肽在体外表现出显著的ACE抑制活性，其IC50值分别为0.114 mg/mL和0.238 mg/mL，并呈现非竞争性和混合型抑制模式。分子对接显示，两种肽均与ACE形成氢键。此外，EFWDSR在4-70 °C温度范围内表现出热稳定性，但在酸性或碱性条件下其ACE抑制活性显著降低。相比之下，FWDSQ在4-50 °C之间保持热稳定性，并在3-9的pH范围内保留ACE抑制活性。在体外模拟胃肠道消化后，两种肽均保留了令人满意的残余活性（>75%）。这些发现表明，抑制肽EFWDSR和FWDSQ作为抗高血压膳食补充剂具有巨大的开发潜力。通常，体外研究需要通过体内实验加以验证。研究人员打算在未来的细胞和动物研究中进一步确立其抗高血压作用。通过结合计算机模拟预测与体外验证的策略，本研究不仅为高效挖掘油茶籽蛋白中的活性肽提供了方法学参考，也为将其应用于功能性食品或特殊医学用途食品提供了科学依据。
