《Journal of Functional Foods》：Casein digest with oligochitosan glycation receives higher activity in the weaned Wistar rats to promote the development of the small intestine
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转谷氨酰胺酶（TGase）诱导的蛋白质糖基化可改变蛋白质特性，但其对幼龄动物蛋白质生物活性的影响尚不清楚。研究人员因此使用寡壳聚糖、酪蛋白（CN）和TGase制备了糖基化酪蛋白（GCN），同时用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别消化CN（或GCN）以获得CN消化物（或含有
转谷氨酰胺酶（TGase）诱导的蛋白质糖基化可改变蛋白质特性，但其对幼龄动物蛋白质生物活性的影响尚不清楚。研究人员因此使用寡壳聚糖、酪蛋白（CN）和TGase制备了糖基化酪蛋白（GCN），同时用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别消化CN（或GCN）以获得CN消化物（或含有6.57 g/kg氨基葡萄糖的GCN消化物）。将90只断奶大鼠（其中6只用于基线）分为7组（对照组、CN或GCN消化物剂量分别为100、200、400 mg/kg体重/天），分别进行7天和28天的饲喂（n=6），以评估大鼠生长、血清生化指标和小肠发育。两种消化物对大鼠生长均无不良影响，且具有相同的促进体重增加的能力，并导致相似的血清生化指标值。此外，GCN消化物在促进肠道发育方面比CN消化物更活跃，导致小肠重量或长度增加更大，绒毛高度或绒毛高度与隐窝深度比值更大，以及三种消化酶（脂肪酶、α-淀粉酶和胰蛋白酶）或关键刷状缘酶（乳糖酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶）活性更高。此外，在早期生长阶段（0–7天）饲喂消化物的大鼠，在反映肠道发育的这些指标上的增加值高于在完整生长阶段（0–28天）饲喂消化物的大鼠。总的来说，这种糖基化被认为是一种更安全、有前景的蛋白质修饰方法，可增强酪蛋白在幼龄动物中的生物活性，因为它可能有益于小肠发育。
**论文解读**
**一、研究背景、问题与目的**
食物蛋白质作为人体必需营养素，其功能特性（如溶解性、乳化性、起泡性和凝胶性）对食品质构、稳定性和加工特性至关重要。蛋白质修饰技术可改变蛋白质功能，从而拓展其在加工食品中的应用范围。转谷氨酰胺酶（TGase，EC 2.3.2.13）是一种在食品工业中研究广泛的转移酶，可催化蛋白质分子内谷氨酰胺和赖氨酸残基之间的共价交联，形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键，从而改变蛋白质结构并优化其功能特性。蛋白质糖基化是另一种重要修饰方式，通过将糖类共价结合到蛋白质上，赋予产物蛋白质功能性与糖类亲水性。美拉德反应是食品工业中最常用的糖基化方法，可有效改善蛋白质的溶解性、乳化性、凝胶性和抗氧化性。然而，美拉德反应存在诸多弊端，如产生丙烯酰胺、苯并芘和晚期糖基化终末产物（AGEs）等有害物质。食物来源的AGEs可被小肠吸收并在体内积累，进而诱发糖尿病、关节炎、动脉粥样硬化和人体器官加速衰老等多种疾病。此外，研究人员先前的研究表明，美拉德型乳糖糖基化酪蛋白消化物对断奶大鼠的体重增长，尤其是小肠发育，产生负面影响。因此，美拉德型蛋白质糖基化需对其不良影响进行深入研究。
为克服美拉德型蛋白质糖基化的局限性，亟需探索替代方法，例如利用含氨基的糖类（如氨基葡萄糖及其衍生物）通过TGase介导的蛋白质糖基化。TGase介导的蛋白质糖基化可提高抗氧化活性、乳化性、凝胶性和热稳定性，同时降低表面疏水性和某些蛋白质的抗原性。与美拉德型相比，TGase型糖基化具有底物特异性高、副产物少、反应条件温和等优点，更适合食品工业应用，且AGEs安全风险较低。更重要的是，研究人员先前发现，通过TGase将寡壳聚糖糖基化到酪蛋白上，可增强酪蛋白消化物在上皮细胞系（即IEC-6细胞）中的屏障保护功能。然而，这种TGase型蛋白质糖基化对机体发育（特别是小肠发育）是否具有积极或消极影响尚不清楚，有待进一步研究。
本研究的目的是评估TGase型寡壳聚糖糖基化对酪蛋白消化物在幼龄动物（断奶Wistar大鼠）中促进生长和小肠发育活性的影响。研究人员制备了糖基化酪蛋白（GCN）及其消化物，并以未糖基化的酪蛋白（CN）消化物为对照，通过测定体重增长、血清生化指标和小肠发育相关指标，明确这种糖基化修饰是否具有负面或正面效应。研究成果发表于《Journal of Functional Foods》。
**二、主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键方法：首先，利用TGase将寡壳聚糖与酪蛋白（CN）共价连接，制备糖基化酪蛋白（GCN），然后分别用胃蛋白酶和胰蛋白酶对CN和GCN进行体外模拟消化，获得CN消化物和GCN消化物。动物实验方面，选用90只雌性无特定病原体（SPF）级断奶Wistar大鼠（初始体重55.19±0.68 g，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司），随机分为7组（对照组、CN消化物或GCN消化物低、中、高剂量组，剂量分别为100、200、400 mg/kg体重/天），每组6只，分别饲喂7天和28天。通过灌胃给药，测定大鼠体重变化、血清生化指标（低密度脂蛋白、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、血尿素氮、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶），以及小肠长度、重量、绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD）和VH/CD比值，并检测十二指肠、空肠和回肠中三种消化酶（脂肪酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶）和三种关键刷状缘酶（乳糖酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶）的活性。数据采用双因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验进行统计分析。
**三、研究结果**
**3.1 大鼠体重增长对两种消化物的响应**
结果显示，GCN消化物含有6.57 g/kg氨基葡萄糖，而CN消化物未检出。两种消化物均未对大鼠体重增长产生不良影响，且与对照组相比，均能轻微提高总增重（2.1–3.7%），但消化物类型和剂量对每日体重增长无显著影响（p>0.05）。然而，在早期生长阶段（0–7天），饲喂两种消化物的大鼠每日体重增长高于完整生长阶段（0–28天），表明两种消化物对早期生长更有效。
**3.2 大鼠血清生化指标对两种消化物的响应**
在饲喂7天和28天后，两种消化物组大鼠的血清低密度脂蛋白、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、血尿素氮、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平与对照组相比均无显著差异，且CN消化物组与GCN消化物组之间也无显著差异，说明寡壳聚糖糖基化未改变酪蛋白消化物对血清生化指标的影响。
**3.3 大鼠小肠指标对两种消化物的响应**
两种消化物均可剂量依赖性地增加小肠重量和长度（p<0.05）。与对照组相比，饲喂CN消化物的大鼠小肠总重量增加10.8–22.7%，总长度增加15.6–35.0%；而饲喂GCN消化物的大鼠小肠总重量增加15.5–23.3%，总长度增加22.0–38.4%。GCN消化物在促进小肠重量和长度增长方面显著优于CN消化物，且早期生长阶段的效果更明显。
**3.4 肠道组织形态变化对两种消化物的响应**
在十二指肠、空肠和回肠中，两种消化物均可提高绒毛高度（VH）和VH/CD比值，降低隐窝深度（CD）。GCN消化物组大鼠的VH和VH/CD值均高于CN消化物组，表明糖基化修饰增强了酪蛋白消化物促进肠道形态发育的能力。早期生长阶段的促进作用更为显著。
**3.5 两种消化物对消化酶和刷状缘酶活性的影响**
两种消化物均可剂量依赖性地提高十二指肠、空肠和回肠中脂肪酶、α-淀粉酶和胰蛋白酶的活性，以及乳糖酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶的活性。GCN消化物在促进这些酶活性方面始终高于CN消化物，且早期生长阶段的效果更突出。此外，GCN消化物特别增强了乳糖酶活性，提示其可能有助于缓解乳糖不耐受问题。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，TGase介导的糖基化可改变蛋白质功能特性和生物活性，且不引起显著氨基酸损失和不良效应。本研究结果证实，GCN消化物在不影响大鼠生长和血清生化指标的前提下，显著促进了小肠发育，包括增加小肠重量和长度、改善肠道形态（提高VH和VH/CD）、增强消化酶和刷状缘酶活性。这些效应在早期生长阶段尤为明显，可能是因为幼龄动物肠道对膳食成分更为敏感。研究还指出，GCN消化物对乳糖酶活性的增强作用可能为解决乳糖不耐受问题提供新策略。
结论部分翻译如下：
总体而言，本研究结果初步证实，与未糖基化的CN消化物相比，TGase诱导的寡壳聚糖糖基化酪蛋白（GCN）消化物不影响断奶大鼠的生长性能和血清生化指标，但显著提高了促进小肠发育的活性。因此，这种TGase型寡壳聚糖糖基化被视为一种有前景的增强酪蛋白或其他蛋白质体内生物活性的方法，糖基化蛋白可被视为具有改善性能和预期生物功能的潜在蛋白质配料。然而，未来仍需深入研究GCN消化物或糖基化蛋白对机体的其他有益效应，以及GCN消化物如何促进小肠乳糖酶产生的问题，这对解决乳糖不耐受人群的临床症状具有重要意义。
