灯盏花乙素通过HIF-1α–CX3CR1轴减轻缺血缺氧后的神经元凋亡

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Scutellarin Alleviates Neuronal Apoptosis After Ischemia and Hypoxia via the HIF-1α–CX3CR1 Axis

　　

摘要

背景：卒中是一种严重的健康威胁，具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率及多并发症的特征。超过70%的卒中为缺血性卒中。减轻缺血缺氧损伤后的神经元凋亡对于有效治疗至关重要。本研究探讨灯盏花乙素在缺血缺氧后对神经元的直接神经保护作用，阐明上调的CX3CR1表达与神经元凋亡之间的关系，并揭示灯盏花乙素通过HIF-1α–CX3CR1轴调控凋亡的机制。本研究为灯盏花乙素在缺血性卒中临床治疗中的应用提供了坚实的理论基础。

方法：在体内建立小鼠短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAO）模型，在体外培养原代神经细胞构建氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型。观察灯盏花乙素在缺血缺氧后对神经元的直接保护作用及其对神经功能和脑梗死体积的影响。利用免疫荧光、蛋白质印迹法及CX3CR1转基因小鼠，测定缺血缺氧后神经元CX3CR1的表达变化及其对凋亡的影响。最后，采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）、免疫荧光和蛋白质印迹法，研究灯盏花乙素是否通过HIF-1α–CX3CR1轴调控NF-κB及JAK1–STAT1通路，进而影响神经元凋亡。

结果：体内外实验证明，灯盏花乙素可减少神经元凋亡，从而缩小MCAO小鼠模型的梗死面积并减轻神经功能缺损。缺血缺氧后，神经元中CX3CR1的表达上调，并介导神经元凋亡。灯盏花乙素通过调控HIF-1α下调CX3CR1的表达。此外，CX3CR1可通过NF-κB/P65和JAK1-STAT1信号通路调节缺血后的神经元凋亡。

结论：实验结果证实，灯盏花乙素通过HIF-1α-CX3CR1轴调节缺血缺氧后的神经元凋亡。这些发现为灯盏花乙素的临床应用提供了额外的理论依据，并提示了缺血性卒中治疗的潜在靶点。

灯盏花乙素通过HIF-1α–CX3CR1轴减轻缺血缺氧后神经元凋亡的机制研究解读

一、研究背景与现存问题

随着全球人口老龄化进程加速，卒中已成为全球第二大死因和第三大致残原因，且有上升为第一大死因的趋势。流行病学数据显示，缺血性卒中占全部卒中患者的70%以上。尽管对缺血性卒中的认识不断深入，其临床管理仍面临巨大挑战。目前，重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）是唯一获批的药物治疗选项，及时再灌注至关重要，但同时存在再灌注损伤和出血转化的风险。因此，开发神经保护策略以保护脑细胞免受损伤并延长溶栓治疗时间窗，是亟待解决的关键临床问题。

天然化合物尤其是灯盏花乙素的神经保护潜力备受关注。已有研究表明，灯盏花乙素对缺血性卒中的保护作用主要涉及调控小胶质细胞极化，通过减少促炎细胞因子释放间接发挥神经保护效应；也有研究发现灯盏花乙素可通过降低诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达或活性发挥直接的神经保护作用。然而，灯盏花乙素在缺血性卒中后对神经元的直接神经保护作用机制仍不明确。

CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）是G蛋白偶联受体家族成员，在中枢神经系统（CNS）损伤后的细胞调控，尤其是神经元凋亡调控中发挥关键作用。既往研究主要关注CX3CR1在小胶质细胞上的表达及其在调控神经炎症和细胞凋亡中的作用，而关于神经元自身CX3CR1表达及其在缺血缺氧后神经元凋亡中的作用，以及灯盏花乙素是否通过调控神经元CX3CR1表达影响凋亡，此前尚无研究报道。

二、研究目的

本研究旨在探讨灯盏花乙素在缺血缺氧后对神经元的直接保护作用，明确上调的CX3CR1表达与神经元凋亡的关系，并阐明灯盏花乙素通过HIF-1α–CX3CR1轴调控凋亡的具体机制，为灯盏花乙素治疗缺血性卒中的临床应用提供理论依据，同时为缺血性卒中治疗寻找潜在的干预靶点。

三、主要技术方法概述

研究人员采用多种实验模型与技术手段开展研究。在体实验方面，建立了小鼠短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAO）模型，并使用CX3CR1基因敲除小鼠（CX3CR1^?/?，品系号KOCMP-13051-Cx3cr1-B6J-VA）及野生型（WT）C57BL/6小鼠，实验动物购自苏州赛业生物科技有限公司。离体实验方面，培养原代神经元和PC-12细胞系（购自ATCC），构建氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型模拟缺血缺氧。主要技术方法包括：激光散斑成像评估脑血流（CBF）、TTC染色测定脑梗死体积、Longa评分评估神经功能、免疫荧光双标染色、蛋白质印迹法（Western blotting）、流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）、转录组测序及生物信息学分析、实时荧光定量PCR（Q-PCR）、免疫共沉淀（Co-IP）、尼氏染色及苏木精-伊红（HE）染色等。

四、研究结果

（一）灯盏花乙素在缺血缺氧后对神经元具有直接保护作用

在WT小鼠tMCAO模型中，与未治疗的MCAO组相比，灯盏花乙素（100 mg/kg）治疗组脑梗死体积显著缩小（从46.22%±5.07%降至32.97%±2.2%，p<0.01），Longa神经功能评分显著改善（p<0.01）。NeuN/caspase-3免疫荧光双标染色显示，MCAO组NeuN和caspase-3双阳性细胞较对照组显著增加，而灯盏花乙素腹腔注射后双阳性细胞数量显著减少。

体外实验中，OGD/R处理的原代神经元出现细胞聚集、胞体肿胀、核固缩、细胞突起崩解等形态学改变，细胞活力下降；灯盏花乙素处理可改善上述形态学变化并提高细胞活力。蛋白质印迹结果显示，OGD/R上调Cleaved caspase-3表达，灯盏花乙素处理后其表达显著下降。流式细胞术结果同样表明，灯盏花乙素处理可显著降低OGD/R诱导的PC-12细胞凋亡比例。以上结果表明，灯盏花乙素可直接减轻缺血缺氧诱导的神经元凋亡。

（二）缺血缺氧后神经元CX3CR1表达上调并导致神经元凋亡

体外OGD/R模型中，蛋白质印迹和免疫荧光分析均显示原代神经元在缺氧条件下CX3CR1表达显著上调（荧光强度从对照组的18.72±2.67升至57.07±8.56）。在体实验中，MCAO组梗死侧脑组织NeuN和CX3CR1双阳性细胞数较对照组显著增加（从263±32/mm²升至1259±91/mm²）。

利用CX3CR1基因敲除小鼠建立MCAO模型，HE染色显示CX3CR1^+/+组梗死侧纹状体、海马及周围脑组织区域细胞呈现典型凋亡特征（细胞体积缩小、胞质浓缩、凋亡小体形成、胞核深染等），而CX3CR1^?/?组凋亡特征明显减轻。尼氏染色结果同样显示CX3CR1^+/+组尼氏体体积和数量减少、染色变浅，而CX3CR1敲除后上述变化得到缓解。蛋白质印迹证实MCAO后WT小鼠梗死脑组织caspase-3表达显著高于CX3CR1敲除小鼠。体外实验中，在OGD/R复氧期加入CX3CR1抑制剂AZD8797后，CX3CR1表达下调，Cleaved-Caspase-3表达相应降低。综合体内外实验结果说明，缺血缺氧导致神经元CX3CR1表达上调并与神经元凋亡相关，敲除CX3CR1可减轻缺血缺氧引起的神经元凋亡。

（三）灯盏花乙素通过调控HIF-1α表达下调缺血缺氧后神经元CX3CR1表达

在体实验中，MCAO后梗死侧脑组织CX3CR1/NeuN双阳性细胞数显著增加（1381±62/mm² vs 对照组334±56/mm²），灯盏花乙素腹腔注射可显著降低神经元上CX3CR1的表达（降至615±60/mm²）。体外OGD/R实验结果一致，灯盏花乙素处理减弱了OGD/R诱导的CX3CR1表达上调。

转录组测序分析显示，模型组与对照组间存在999个差异表达基因（486个上调、513个下调），治疗组与模型组间存在201个差异表达基因（71个上调、130个下调），其中多个基因涉及NF-κB和JAK1-STAT1通路。KEGG通路富集分析提示HIF-1为共同上游调控因子。免疫共沉淀实验证实了在灯盏花乙素处理及缺血缺氧模型条件下HIF-1α和CX3CR1在神经元细胞中存在物理相互作用。使用HIF-1α抑制剂（HY-146144）的体外实验显示，HIF-1α水平显著降低后CX3CR1表达相应下降。以上结果共同表明，灯盏花乙素通过调控HIF-1α表达来降低缺血缺氧后神经元中CX3CR1的表达。

（四）灯盏花乙素通过HIF-1α-CX3CR1轴调控NF-κB通路抑制神经元凋亡

研究人员进一步研究了CX3CR1抑制剂AZD8797与灯盏花乙素联合处理的效果。蛋白质印迹分析显示，CX3CR1阻断可消除灯盏花乙素诱导的NF-κB通路下游效应，但不影响上游调控因子HIF-1α和CX3CR1的表达水平。对NF-κB通路关键蛋白的分析显示，灯盏花乙素处理后HIF-1α、CX3CR1、p-IκB/IκB和p-P65/P65水平较OGD/R组显著降低。这些结果表明，灯盏花乙素通过HIF-1α–CX3CR1轴调控NF-κB通路蛋白，从而改善缺血缺氧后的神经元凋亡。

（五）灯盏花乙素通过HIF-1α-CX3CR1轴调控JAK1-STAT1通路抑制神经元凋亡

体外实验使用不同浓度的CX3CR1抑制剂AZD8797处理神经元细胞，蛋白质印迹结果显示JAK1和STAT1的磷酸化水平随AZD8797浓度增加呈剂量依赖性下降。STAT1激活剂HY-W013523预处理可逆转AZD8797对JAK1和STAT1磷酸化水平的抑制作用。CX3CR1抑制剂与灯盏花乙素联合实验显示，CX3CR1阻断可消除灯盏花乙素诱导的JAK1-STAT1通路下游效应。进一步分析表明，灯盏花乙素处理后HIF-1α、CX3CR1、p-JAK1/JAK1和p-STAT1/STAT1蛋白水平较OGD/R组显著降低。本研究首次在神经元缺血缺氧模型中证实了该通路参与，为灯盏花乙素治疗缺血性卒中提供了新的理论框架。

五、讨论总结

缺血性卒中的危险因素包括年龄、高血压、糖尿病、心房颤动和高胆固醇血症等。缺血性卒中剥夺脑细胞的氧气和能量供应，导致细胞代谢紊乱，其损伤机制涉及兴奋性毒性、氧化应激、硝化应激、炎症和凋亡等多种病理生理过程。既往关于灯盏花乙素神经保护作用的研究主要集中在抗氧化应激和抑制凋亡方面，但直接研究其对神经元保护作用的报道较少，大多通过调控胶质细胞极化发挥作用。本研究证实灯盏花乙素可直接减少缺血缺氧引起的神经元凋亡。

CX3CR1在CNS中发挥重要作用，在不同疾病模型中具有差异化的功能。既往对缺血性卒中中CX3CR1的研究主要聚焦于小胶质细胞，本研究首次证实缺血缺氧后神经元CX3CR1表达上调且敲除CX3CR1可减少神经元凋亡。关于HIF-1α与CX3CR1关系的研究此前主要集中于肿瘤领域，本研究首次揭示在神经元中HIF-1α可调控CX3CR1表达。关于CX3CR1与NF-κB及JAK/STAT通路的关系，既往研究较少且主要在其他细胞类型中进行，本研究首次在神经元缺血缺氧模型中证实CX3CR1通过NF-κB/P65和JAK1-STAT1通路调节神经元凋亡。

六、研究结论

本研究揭示，缺血缺氧后神经元CX3CR1表达升高，CX3CR1基因缺失对缺血性卒中具有保护作用。在机制层面，灯盏花乙素通过调控HIF-1α降低CX3CR1 mRNA水平，进而减少CX3CR1蛋白表达。CX3CR1通过NF-κB/P65和JAK1-STAT1通路参与缺血后神经元凋亡的调控。本研究的主要发现包括：（1）灯盏花乙素对神经元具有直接神经保护作用；（2）缺血缺氧模型中神经元CX3CR1表达上调，与神经元凋亡相关；（3）灯盏花乙素通过HIF-1α-CX3CR1轴调控缺血缺氧后神经元中NF-κB/P65和JAK1-STAT1通路，影响凋亡过程。这些结果为灯盏花乙素的临床应用提供了基础，并为缺血性卒中管理提供了潜在的治疗靶点。