在活体细胞中，通过单分子追踪方法研究了CHD家族染色质重塑因子Hrp3在S. pombe（秀丽隐杆线虫）中的行为，揭示了其结合动态与染色质环境的相关性

《Journal of Molecular Biology》：In vivo single-molecule tracking of CHD family chromatin remodeler Hrp3 defines the chromatin context-dependent binding dynamics in S. pombe

　　

摘要

CHD家族的ATP依赖性染色质重塑因子参与基因组组织和转录的调控，但它们在天然染色质中的动态行为仍不清楚。在此，我们对活的Schizosaccharomyces pombe细胞中的CHD重塑因子Hrp3进行了体内单分子追踪，以量化其染色质相互作用动态。通过生成域缺失突变体（Δchromo、ATPase^K406A（ATP酶缺失型）、Δcoupling region、DNA结合域（ΔSANT、ΔSLIDE）和ΔDUF），我们系统地分析了每个域在体内对DNA结合的贡献。虽然一些观察结果与之前的体外研究一致，但关键差异凸显了细胞染色质环境对重塑因子功能的重要影响。我们发现Hrp3仅与恒定异染色质结合，而不与常染色质或兼性异染色质结合。我们测试了组蛋白乙酰化和甲基化改变对Hrp3染色质结合动态的影响。我们的数据表明Hrp3的结合取决于染色质背景：降低乙酰化程度可使其与常染色质结合，增加乙酰化程度则会降低其与异染色质的结合；而减少甲基化程度则增加其与异染色质的结合。有趣的是，我们发现Hrp3与有丝分裂期的染色体具有特异性结合，这暗示了其在维持异染色质沉默中的作用，并可能参与了表观遗传信息的传递。总体而言，我们的结果表明Hrp3的染色质结合对表观遗传修饰和染色质压缩非常敏感，不能仅通过体外研究来完全预测其行为。鉴于CHD重塑因子的保守性及其与人类疾病的关联，这项研究提供了关于表观遗传疗法（如HDAC抑制剂）如何调节染色质重塑因子动态并影响基因表达的重要见解。

章节摘录

引言

真核生物的基因组被打包成染色质，这是一种动态的核蛋白结构，它调节DNA的可及性，从而控制着转录、复制和修复等重要过程。染色质组织由组蛋白修饰、DNA甲基化以及ATP依赖性的染色质重塑复合物共同控制，这些复合物通过重新定位、移除或重构核小体来调节基因组功能[1, 2]。其中，染色域解旋酶DNA结合（CHD）家族

酵母菌株的遗传工程用于活细胞核中Hrp3的单分子成像

为了在活的S. pombe细胞中可视化Hrp3的单分子，我们将自标记酶HaloTag内源融合到hrp3基因的C末端，实现了可控的荧光标记（图1A）[17]。为了精确定义单分子追踪的细胞核边界，我们还在其内源位点用GFP标记了 cohesionin亚基Rad21。通过点样检测评估了该菌株的适应性，结果显示其与野生型相比没有可检测到的生长缺陷

Hrp3-HaloTag的单分子成像和追踪揭示了其在细胞核中的染色质结合动态

为了量化活S. pombe细胞中Hrp3的染色质结合行为，我们对表达Hrp3-HaloTag的对数期培养物用100 nM JF646-HTL进行标记，并拍摄了单分子追踪的延时视频。为了捕捉广泛的动态行为，我们在两种采集模式下进行了成像：一种是慢速模式（50 ms曝光时间，150 ms间隔），用于量化染色质驻留时间；另一种是快速模式（10 ms曝光时间，连续采集），用于确定扩散情况

Hrp3的不同域在体内对染色质结合有不同的贡献

Hrp3是一种多结构域的染色质重塑因子，包含串联的染色域（双CD）、一个ATP酶马达、一个耦合区域、DNA结合域（SANT和SLIDE）以及一个功能未知的域（DUF）（图2A）。虽然SANT和SLIDE域已知直接参与DNA相互作用，但之前的体外研究表明，包括染色域、ATP酶、耦合区域和DUF在内的其他域也共同调节核小体的结合和重塑活动[23, 24]。然而，

Hrp3与异染色质和常染色质的相互作用动态不同

研究表明Hrp3参与S. pombe中的异染色质组织和转录沉默[25, 26]。然而，其在异染色质和常染色质中的染色质相互作用动态是否存在及其差异尚不清楚。为了解决这个问题，我们使用Swi6-GFP（一种已建立的恒定异染色质标记物[27]）标记了异染色质区域，并对Hrp3-HaloTag在恒定异染色质和常染色质上的分布进行了空间分辨的单分子追踪

组蛋白乙酰化是S. pombe中染色质可及性和转录活性的关键决定因素。保守的组蛋白乙酰转移酶Gcn5主要在启动子和应激响应基因处催化组蛋白H3（例如H3K9ac和H3K14ac）的乙酰化，其活性主要局限于常染色质[29, 30]。相比之下，异染色质通常乙酰化程度较低，反映了更加紧凑且转录抑制的状态。鉴于我们之前的结果表明

讨论

在这项研究中，我们使用体内单分子成像技术定义了CHD家族重塑因子Hrp3在酵母S. pombe中的染色质相互作用动态。通过结合定量追踪和系统性的域缺失分析，我们提供了关于单个结构模块如何在天然细胞核环境中参与染色质结合的全面见解，而这些是在体外研究中无法预测的。我们的发现表明，Hrp3在体内的行为不仅受到其内在特性的影响

酵母菌株的遗传工程

通过同源重组将HaloTag>>HygR引入hrp3-TAP>>KaMX6的3’UTR区域，生成了hrp3-HaloTag>>HygR等位基因（图S4）。使用MO398、MO326 - MO328引物通过重叠PCR扩增得到了所需片段[17]。通过抗Hygromycin能力和同时对抗G418的敏感性筛选出了阳性转化株。gcn5基因通过在缺乏尿嘧啶的酵母菌株（ura4-d18）中引入ura4+选择标记被完全删除

将细胞从甘油储备液中划线接种到添加了酵母提取物的琼脂（YESA）平板上，并在30 ℃下培养72小时。从一个菌落中挑取单个菌落接种到5 mL的EMM培养基（Edinburgh’s Minimal Media，MP Biomedicals，产品编号4110-012）中，并在30 ℃、230 rpm的摇动条件下培养48小时。随后，将50 μL的培养液稀释到3 mL新鲜的添加了补充物质的EMM培养基中，并继续培养8-10小时以达到对数期。对于HaloTag标记，取1 mL的培养液

将菌株新鲜划线接种到YES（添加了酵母提取物的）琼脂平板上。从单个菌落开始培养至对数期（OD₆₀₀ =1）。进行10倍连续稀释至10^-4浓度，然后将每个稀释度的3-5 μL样品点涂在YES琼脂平板上，并在30 °C下培养。使用凝胶记录系统拍摄图像。

对数生长阶段的细胞（OD_6_0_0 ～0.6）用TBZ（45 μg/mL，4小时，30°C，摇动）处理，未处理的细胞作为对照。免疫荧光实验按照之前的方法[42]进行了一些修改。具体步骤为：将10 mL的培养液在-20°C下用甲醇固定10分钟，然后用PBS洗涤三次。接着用0.5 mg/mL的Zymolyase 20T和1 mg/mL的裂解酶在37°C下处理30分钟进行细胞溶解。再用PBS洗涤三次后，用PBS封闭细胞

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作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

我们感谢瑞典卡罗林斯卡学院的Karl Ekwall教授提供Hrp3域缺失菌株，以及韩国高等科学技术院的Daeyoup Lee教授提供Hrp3 ATP酶突变菌株。我们还感谢日本国际协力机构（JICA）与海得拉巴印度理工学院的合作，为TIRF显微镜的购置提供了资金支持。GM感谢生物技术新兴前沿部门的资助

Akriti Kumari|Oankar Varde|Varsha Gopi|Eerappa Rajakumara|Mridula Nambiar|Gunjan Mehta

海得拉巴印度理工学院生物技术系染色体动力学与基因调控实验室，Kandi, Sangareddy, Telangana 502285, India