《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Enhancing Probiotic Performance in Food Matrices: From Strain Selection to Bioengineering
益生菌是功能性食品创新的核心，但其应用受到加工、储存和胃肠（GI）转运过程中活力损失的限制。一个关键见解是，活力与功能性是不同属性；维持高细胞计数并不能保证益生菌保留其有益特性。尽管有大量关于个体益生菌递送策略的文献，但此前没有综述将菌株筛选、基质设计、保护技术和生物工程整合到一个单一的端到端框架中。本综述研究了增强益生菌在食品基质中性能的策略，强调有效递送需要同时保留活力和功能性。基于应激耐受性的菌株筛选和通过亚致死暴露的适应是提高稳健性的关键方法。乳制品基质为益生菌提供固有保护，而非乳制品系统（包括水果、谷物、肉类和巧克力）则需要补充技术以增强益生菌存活。微胶囊化方法，包括喷雾干燥、挤出、乳化和电喷雾，增强了益生菌稳定性并实现靶向GI释放。此外，益生元共包封和合生元制剂通过协同效应改善存活和功能性。基因工程（包括基于CRISPR的工具）的进展使得开发具有增强应激耐受性和代谢能力的下一代益生菌成为可能，尽管仍存在监管挑战。研究人员得出结论，有效的益生菌递送依赖于将菌株筛选、基质设计、保护技术和生物工程整合到特定应用中，同时在整个货架期内保持功能性。
本综述以叙述性综述形式进行，涵盖菌株筛选、食品基质、包封技术和益生菌基因工程策略等广泛多学科主题。在PubMed、Scopus、Web of Science和Google Scholar电子数据库中进行了系统检索，时间范围覆盖2000年至2026年3月，优先考虑近10年（2016–2026年）的文献，同时保留历史关键参考文献。使用的检索词和布尔运算符包括：“probiotic”、“lactic acid bacteria”、“Bifidobacterium”、“viability”、“survival”、“stability”、“food matrix”、“encapsulation”、“microencapsulation”、“spray drying”、“freeze drying”、“stress adaptation”、“cross-protection”、“prebiotic”、“synbiotic*”、“genetic engineering”、“CRISPR”、“bioengineering”。通过手动筛选纳入研究及相关综述的参考文献列表补充了额外文章。纳入标准为：同行评审期刊发表的原创研究、综述和临床研究；报告益生菌在食品系统中活力或功能性定量数据的研究；英文文章。排除标准为：会议摘要；无原始数据或方法描述不清的研究；仅关注临床结果而无技术相关性的文章。文献筛选由两位作者独立进行，先筛选标题和摘要，再评估全文，分歧通过讨论解决，必要时咨询第三作者。证据等级区分如下：同行评审原创研究（体外研究、动物模型和人体临床试验）视为主要证据；综述用于背景综合；行业报告和市场数据仅用于经济背景，不作为科学有效性证据。提及的商业产品或新闻稿明确标识为说明性示例，而非对照科学证据。
**3 Limiting Factors for Probiotic Application in Foods**（益生菌在食品中应用的限制因素）
**3.1 Safety and Compatibility With the Food Matrix**（安全性与食品基质兼容性）
将菌株鉴定为益生菌需进行全面的安全性和功能性评估，包括分子鉴定、酸和胆汁耐受性体外评估、黏附、抗菌活性及胆汁盐水解酶（bile salt hydrolase）活性。扩展框架包括对抗生素耐药基因、毒力因子、毒素产生、溶血及生物胺的基因组筛选。将益生菌掺入食品基质可能影响风味、质地和外观，需进行兼容性评估以保持感官品质。益生菌代谢通过有机酸、乙醇、双乙酰、胞外多糖（exopolysaccharides, EPSs）和挥发性化合物影响感官特性，不同菌株产生不同挥发性谱，包括醇类、醛类、酮类和酯类，需进行菌株和基质特异性感官评价。
**3.2 From Processing to GI Transit: The Viability–Functionality Gap**（从加工到胃肠转运：活力-功能性差距）
加工条件是益生菌失活的主要原因，细胞暴露于连续累积的应激。例如，高温短时巴氏杀菌（72°C，15秒）使Lacticaseibacillus casei活力下降约1.5–2.0 log CFU/mL，超高温处理（135°C，2–4秒）导致几乎完全失活（4–5 log下降）。喷雾干燥出口温度70–80°C导致大多数乳杆菌活力下降1–3 log，而冷冻干燥则导致双歧杆菌活力下降0.5–1.5 log。基质特异性因素也影响存活，如低pH果汁中Lactobacillus rhamnosus GG在14天内下降2–4 log CFU。加工后失活主要与氧化应激和活性氧（reactive oxygen species, ROS）有关。加工、基质组成和储存可能损害益生菌功能性，即使活力计数保持充足，如双歧杆菌和L. casei可能失去胆汁盐水解酶活性和黏附能力。相反，食品基质可正向影响功能性，如L. rhamnosus GG在乳制品基质中展现更强肠细胞黏附。固体和半固体食品通过缓冲能力和物理保护增强胃转运存活。GI转运中，益生菌暴露于pH梯度、消化酶和胆汁盐，并面临氧气张力、营养限制、高渗透压、ROS及蠕动机械力，孢子形成细菌如Bacillus coagulans和Bacillus clausii因休眠孢子高度耐受低pH、高温和机械应力而具有优势，真核益生菌如Saccharomyces boulardii因细胞壁结构而耐受性高。常驻微生物群通过竞争和抗菌代谢物限制外源益生菌持久性。这些障碍表明，单一菌株无法满足所有性能要求，活力不足以保证功能性。
**3.3 Regulatory Framework and Dosage Requirements for Probiotics**（益生菌监管框架与剂量要求）
欧洲食品安全局（EFSA）要求通过全基因组测序进行菌株鉴定、安全性评估（无抗生素耐药基因、毒力因子和毒素）及至少一项人体干预研究证明健康益处。美国食品药品监督管理局（FDA）采用一般公认安全（GRAS）框架。尽管FAO/WHO建议消费时106–109 CFU/g，但监管机构并未普遍规定固定阈值，而是要求剂量与临床研究中有效剂量匹配。巴西ANVISA要求声明货架期末活菌计数并科学证明健康声明，但未设定最低阈值。这凸显了协调国际指南的必要性。
**4 Strategies to Improve the Viability of Probiotics in Food Matrices**（改善益生菌在食品基质中存活的策略）
**4.1 Strain Selection and Intrinsic Stress Tolerance**（菌株筛选与内在应激耐受性）
菌株筛选依赖模拟加工和储存恶劣条件（热、低pH、高乳酸、乙醇和NaCl）的方法。内在耐受性高的菌株更受青睐，如Lactiplantibacillus plantarum Y1在pH 2.0下酸耐受>5.0 log CFU/mL，胆汁耐受6.5 log CFU/mL；Bacillus coagulans MTCC 5856孢子热耐受性高（90°C下D值35.71），适合热加工食品。乳酸菌对盐和酸度耐受性重要，如奶酪相关菌株需耐受4%–6% NaCl和宽pH范围。
**4.2 Stress Adaptation and Cross-Protection Mechanisms**（应激适应与交叉保护机制）
通过亚致死应激暴露可增强益生菌稳健性，即交叉保护：一种温和应激触发全局应激反应，增加对其他更严重应激的耐受性。此过程由应激相关基因上调、分子伴侣（GroEL和DnaK）及膜脂肪酸组成调整介导。例如，Ligilactobacillus salivarius SS1短期暴露于氧化、酸、渗透或胆汁应激后，70°C下耐热性提高1.3–1.6倍（85.7%–98.9%）。Lactococcus lactis经渗透（8% NaCl）、酸性（pH 4.5）或氧化（1 mM H
2O
2）应激后，干燥和储存期间抵抗力提高，氧化预适应使喷雾干燥损失仅0.01 log，储存45天后活力提高112.5%。亚致死高压均质（50 MPa）增强Lacticasibacillus paracasei A13在奶酪和模拟胃条件下的存活，通过上调脂肪酸生物合成基因（accA、fabD、fabZ）改善膜完整性。代谢组学分析揭示L. casei AP在热应激下产生核苷酸、肽和膜稳定化合物等适应性变化。
**5 Application of Probiotics in Food Systems**（益生菌在食品系统中的应用）
**5.1 Probiotic Survival Across Different Food Matrices**（益生菌在不同食品基质中的存活）
乳制品被视为益生菌递送的“金标准”，因其高缓冲能力（pH 4.0–4.5）、酪蛋白网络限制酸和胆汁盐扩散、脂肪球创造疏水微环境。非乳制品基质在某些条件下可接近此性能，如椰子水发酵后双歧杆菌计数>12 log CFU/mL，储存42天后仍>6 log CFU/mL。豆乳中L. rhamnosus活力达10.47 log CFU/mL（游离细胞）和12.98 log CFU/mL（合生元固定化细胞）。植物基质中，B. coagulans孢子因固有耐热性，烹饪后谷物产品中计数>8 log CFU/g。巧克力保护基于低水活度（a
w < 0.5）和高脂肪含量提供胃酸疏水屏障。果蔬汁因低pH（2.5–4.0）和缺乏缓冲成分提供最小保护，如橙汁中模拟GI转运后种群降至3.80 log CFU/mL。肉类产品中，孢子形成菌如B. coagulans和B. subtilis孢子经烹饪后保持高活力，但营养细胞大量失活。发酵肉制品因无热处理、脂肪-蛋白质基质和发酵产生的保护性化合物而有利于益生菌存活。通过包封、益生元掺入和脂肪补充可缩小乳制品与挑战性非乳制品基质之间的性能差距。
**5.2 Technological Strategies to Enhance Probiotic Survival**（增强益生菌存活的技术策略）
**5.2.1 Prebiotics as Synergistic Protectors**（益生元作为协同保护剂）
益生元如低聚果糖（FOS）、低聚半乳糖（GOS）、低聚木糖（XOS）、菊粉、抗性淀粉、果胶和β-葡聚糖常作为生长促进剂掺入。合生元组合通过协同效应改善存活、定殖和健康益处。益生元的多重机制包括：作为可发酵底物刺激有益菌群、作为冷冻保护剂、作为结构成分创造保护性微环境。在乳制品基质中，菊粉和FOS在储存和模拟消化期间增强益生菌活力和短链脂肪酸产生。在冷冻乳制品中，菊粉兼具冷冻保护剂作用。植物来源提取物（如硒富集绿茶提取物、腰果花提取物）通过多酚抗氧化活性和可发酵底物作用增强益生菌存活。益生元还可影响代谢活性，如γ-氨基丁酸（GABA）产生。保存条件需定制以保留功能性属性，而不仅仅是细胞计数。
**5.2.2 Probiotic Encapsulation: Principles, Mechanisms, and Technology Selection**（益生菌包封：原理、机制与技术选择）
包封通过四种主要机制保护益生菌：物理屏障、pH响应释放、机械保护和氧气控制。喷雾干燥适用于干食品应用，但高温损伤非孢子形成细胞，活力保留60%–90%。冷冻干燥保留70%–95%活力，但成本高且分批操作。挤出（离子凝胶化）和电喷雾为温和技术，但挤出胶囊尺寸大（~1 mm）可能影响质地。乳化可规模化，产生10–100 μm颗粒，氧气屏障好。凝聚法包封效率高但复杂且成本高。多层纳米涂层提供优越保护但可扩展性低。包封必须保留功能性，因为亚致死损伤可能损害功能性。包封材料需GRAS或QPS状态，如海藻酸钠、壳聚糖（日本、欧盟、美国GRAS认定）、明胶、乳清蛋白和菊粉。包封可能影响食品质地和口感，选择策略应基于基质：高酸果汁中使用海藻酸盐或海藻酸盐-壳聚糖珠；高脂基质中直接掺入通常足够；婴儿配方奶粉中喷雾干燥使用乳制品载体；发酵肉制品中挤出法优选；谷物棒和烘焙食品中优先使用孢子形成菌；澄清饮料中需要乳化技术产生<100 μm颗粒。
**6 New Generation of Probiotics Produced by Genetic Engineering for Food Application**（基因工程生产的下一代益生菌在食品中的应用）
**6.1 Food-Relevant Engineering Strategies**（食品相关工程策略）
**6.1.1 Stress Tolerance Enhancement**（应激耐受性增强）
通过表达甜菜碱摄取系统BetL（来自Listeria）在Limosilactobacillus salivarius UCC118中，提高了对渗透、冷冻、气压和冷应激的耐受性，并增强喷雾和冷冻干燥后存活。将betL和bilE整合到Bifidobacterium breve UCC2003中，增加胃液和胆汁盐存活。表达海藻糖合成操纵子ostAB（来自Escherichia coli）和海藻糖合成基因（来自Propionibacterium freudenreichii）在Lactococcus lactis中，改善冷冻干燥存活、胆汁耐受和酸耐受。表达过氧化氢酶基因katE（来自Bacillus subtilis）和超氧化物歧化酶基因sodA（来自Streptococcus thermophilus）在Bifidobacterium longum中，提供协同ROS保护。
**6.1.2 Metabolic Pathway Optimization**（代谢途径优化）
乳酸菌产生多种生物活性代谢物，包括GABA、EPS、共轭亚油酸（CLA）和细菌素，改善风味、质地和营养品质。工程化S. thermophilus菌株表达增强蛋白水解系统，可加速加工并支持减糖食品、风味增强剂和质构剂的生产。改造益生菌可增加特定细菌酶产量，防止生物活性肽过度降解，保留其生物活性。
**6.1.3 CRISPR–Cas9 and Food-Grade Selection Markers**（CRISPR–Cas9与食品级选择标记）
利用内源性CRISPR–Cas系统，特别是CRISPR–Cas9，实现益生菌精准高效遗传修饰。Tang等（2026）开发了整合CRISPR–Cas9介导敲入与Cre/loxP驱动基因组减少的双基因组工程策略，简化L. lactis NZ9000基因组并实现高活性尿酸酶变体稳定表达。Z. Xie等（2026）利用内源性II-A型CRISPR–Cas系统在L. rhamnosus GG中实现功能工程，确认PAM要求为5′-NGAAA-3′，开发基因组编辑工作流程，实现多个位点靶向缺失和插入（编辑效率11.1%–25.0%）。食品应用中需消除抗生素耐药标记，开发了基于丙氨酸消旋酶（alr）基因的食品级选择标记，在L. lactis和L. plantarum中实现无抗生素筛选，质粒稳定维持超过200代。乳链菌肽控制表达系统也用于无抗生素的受控基因表达。
**6.2 Regulatory Barriers for Engineered Probiotics in Food**（工程化益生菌在食品中的监管障碍）
目前尚无基因修饰益生菌获准作为食品产品在欧盟商业化，仅少数在美国通过特定框架进入市场。欧盟法规要求基因修饰微生物（GMM）用于食品需经过全面安全性测试，EFSA QPS清单目前排除所有基因修饰微生物。任何工程化益生菌必须根据（EU）2015/2283法规进行完整新型食品授权程序，耗时3–5年且成本高昂。在食品应用中，改良发酵剂培养物可能比独立补充剂更具可行性。美国FDA的GRAS框架被认为限制较少，但大多数工程化益生菌作为膳食补充剂受到新膳食成分（NDI）通知框架监管。实际中，尚无基因修饰益生菌作为食品添加剂或功能性食品成分获准进入全球主要市场。监管瓶颈和消费者对GMO的抵制解释了为何几乎所有商业益生菌产品仍使用非工程化菌株。安全性评估需全面基因组评价，包括全基因组测序、毒力因子筛选和抗生素耐药性分析。对于修饰益生菌，需证明修饰不会引入致病性或可转移耐药基因。
**6.3 Outlook**（展望）
基因工程为增强益生菌存活、应激耐受性和代谢能力提供强大工具，但监管和消费者接受度仍是商业化主要障碍。成功转化需：持续开发无抗生素耐药标记的食品级载体；与GRAS/QPS框架对齐并提交全面安全性数据；透明风险沟通；证明明确功能益处以证明额外监管负担合理。未来，基因工程可实现从“一刀切”益生菌到应用特异性设计的范式转变，通过协同优化菌株基因型和食品基质组成。此外，工程化菌株原位产生保护性代谢物可简化配方并符合清洁标签趋势。目前，非GMO方法如应激适应、包封和后生元制剂在食品应用中仍更直接可行。
**7 Conclusion**（结论）
本综述支持两个指导假设：第一，基质固有属性解释了益生菌存活和功能性的显著变异，乳制品提供固有保护，而水果汁和谷物棒等需额外策略。第二，工程方法在与基质适当设计整合时最有效，而非单独应用。策略（菌株筛选、基质设计、包封、益生元和生物工程）是互补工具，应根据特定应用选择。活力与功能性是不同属性，菌株需保持高细胞计数并保留功能性特征。关键趋势包括：整合组学和AI进行菌株-基质设计并同时评估活力与功能性；通过创新包封扩展下一代益生菌；应用生物工程并辅以稳健生物安全评估；协调监管框架以在功效评估中区分活力与功能性。作为叙述性综述，本文未包含系统定量荟萃分析，实验条件异质性限制结果直接可比性，大多数研究为体外或离体数据，人体临床试验有限，且主要关注传统益生菌属。尽管存在这些局限性，本综述提供了当前策略的全面综合并识别了未来研究的关键空白。
