极性诱导荧光开启用于骨骼肌及邻近组织的体内成像

《Microchemical Journal》：Polarity induced fluorescence turn-on for in vivo imaging of skeletal muscles and adjacent tissues

　　

环境敏感探针与肌肉蛋白结合产生大的荧光开启。同时检测肌肉和邻近组织，显示不同颜色。用于监测肌肉结构变化的体内成像。

**论文解读：极性诱导荧光开启探针用于骨骼肌及邻近组织的体内成像**

**研究背景与问题**
骨骼肌是脊椎动物运动功能的核心组织，其基本结构单位为肌节（sarcomere），由平行排列的细肌丝（肌动蛋白、原肌球蛋白）和粗肌丝（肌球蛋白）构成，Z线（Z-band）界定肌节边界。肌节内蛋白的精确组装和功能维持对肌肉发育和疾病至关重要。斑马鱼（zebrafish）因其透明性和高肌肉含量，成为研究人类骨骼肌疾病（如肌营养不良症）的理想模式生物。然而，现有成像方法存在明显局限：免疫荧光（immunofluorescence）虽能揭示肌节结构，但需要固定、切片、抗体孵育等复杂步骤，耗时2-4天，且不适用于活体样本；二次谐波生成（SHG）成像虽可显示肌节，但信号弱、分辨率低，难以提供细胞结构细节。因此，亟需开发一种简单、快速、无毒的活体成像方法，以同时观察肌肉纤维、肌间隔（myoseptum）、内肌膜（endomysium）等邻近组织，并监测肌肉结构变化。

**研究内容与结论**
研究人员利用环境敏感型黄酮类（flavonoid）染料1，通过极性诱导荧光开启（turn-on）机制，实现了斑马鱼活体骨骼肌及邻近组织的高对比度成像。该染料在低极性环境中（如蛋白质疏水口袋）荧光显著增强，而在水相中几乎无荧光，从而避免了背景干扰。通过简单浸泡染色，染料1在30分钟内进入斑马鱼幼鱼体内，产生强绿色荧光，并能同时显示不同颜色的组织：肌肉纤维呈亮绿色，肌间隔呈弱蓝色，内肌膜和脂滴呈明亮荧光。在300倍放大下，研究人员清晰观察到肌节结构，包括A带（A-band）、Z线（Z-band）和H带（H-band），相邻Z线距离约2 μm，与免疫荧光结果一致。此外，在低氧（hypoxic）条件下，染料1还揭示了肌肉组织中脂滴积累和形态异常。该研究表明，环境敏感型荧光染料可通过与不同极性蛋白的结合，实现多组分同时成像，为肌肉发育、疾病研究和药物筛选提供了简便、无毒、可活体成像的新工具。该论文发表在《Microchemical Journal》。

**关键技术与方法**
研究人员使用环境敏感型黄酮类荧光染料1（化合物1），通过其极性诱导的荧光开启特性，实现活体斑马鱼骨骼肌成像。主要技术方法包括：1）荧光寿命测量（time-resolved fluorescence）：在甲苯、二氯甲烷（DCM）、二甲基亚砜（DMSO）和水等不同溶剂中测定荧光衰减曲线，分析激发态成分（局部激发态LE、分子内电荷转移态ICT、氢键态）；2）斑马鱼活体染色与共聚焦显微镜成像：将斑马鱼胚胎/幼鱼（24-96 hpf，小时受精后）浸泡于10 μM染料1溶液中30分钟，使用405 nm激光激发，在450 nm（蓝通道）和525 nm（绿通道）检测荧光，获取不同放大倍数（20×、100×、300×）图像；3）低氧模型建立：将斑马鱼置于低氧水环境（O₂水平4-4.5 mg/L）中培养至96 hpf，与常氧组（O₂水平约8.9 mg/L）对比，观察肌肉结构变化。样本来源为斑马鱼胚胎（野生型）。

**研究结果**
**2.1 荧光寿命研究**
在不同溶剂中测量染料1的荧光寿命，发现其在极性溶剂（如DCM、DMSO）中主要呈现单指数衰减（τ₃，寿命约2-3 ns），归因于ICT态；在非极性溶剂（甲苯）中，LE态和ICT态并存；在水中，主要成分（α₁≈96%）呈现极短寿命（τ₁=0.007 ns），归因于氢键态（H-bonding state）。该结果解释了染料1在极性环境中荧光微弱、在非极性疏水环境中荧光增强的机制。

**2.2 斑马鱼肌肉成像**
将96 hpf斑马鱼幼鱼浸泡于10 μM染料1中30分钟，共聚焦显微镜显示：染料迅速进入鱼体，全身呈现强绿色荧光，且为非均匀分布——肌肉纤维（绿色通道）和肌间隔（蓝色通道）可清晰区分（图2）。肌间隔主要由胶原蛋白和蛋白聚糖组成，极性低于肌肉，因此染料1与肌间隔结合后发射波长蓝移，产生蓝色荧光。叠加图像增强了对比度，证实该染料可实现多组分同时成像。

**2.3 发育研究（24-96 hpf）**
从24 hpf至96 hpf追踪肌肉发育：24 hpf时，成肌细胞（myoblast）未组织化，核大；48 hpf时，细胞开始融合形成多核肌管（myotube）；72 hpf时更多融合完成；96 hpf时，肌肉纤维呈现成熟骨骼肌特征（图3）。该模式与已知斑马鱼肌肉发育一致，表明染料1可无创监测活体肌肉发育过程。

**2.4 低氧条件下的成像**
与常氧组相比，低氧条件下96 hpf斑马鱼躯干肌肉出现大量明亮绿色小点，推测为脂滴（lipid droplets）积累。同时，低氧鱼发育迟缓、躯干弯曲、肌肉组织非均匀生长，形态类似24-48 hpf的未成熟肌肉（图4）。染料1通过同时显示肌肉、肌间隔和脂滴，为低氧疾病模型研究提供了便捷工具。

**2.5 高分辨肌节结构成像**
在300倍放大下，染料1染色揭示了躯干横纹肌的精细结构：清晰可见A带（肌球蛋白和肌动蛋白重叠区）绿色荧光，Z线（含肌联蛋白）未被染色而呈暗带，H带（肌节中央非重叠区）呈微弱荧光（图5）。相邻Z线间距约2 μm，与免疫荧光数据一致。此外，内肌膜（个体肌纤维周围的结缔组织）被强烈标记，进一步说明该染料能结合细胞外基质成分。

**总结与讨论**
研究结论部分指出：一种具有溶剂化显色性（solvatochromatic）的无毒黄酮类染料1能够有效染色肌肉组织，通过结合肌肉蛋白疏水口袋诱导荧光开启，从而在活体斑马鱼中清晰显示基本肌节单位（sarcomere）及其相关的肌间隔和内肌膜。该方法为揭示肌肉微结构及其邻近生物结构提供了新策略，证明了环境敏感型蛋白结合染料可通过在不同生物环境中产生波长位移，实现多目标同时成像。该方法的简便性及活体成像潜力，有望在肌肉相关研究（如肌营养不良症治疗、肌肉损伤修复）中得到广泛应用。此外，染料1在常氧和低氧条件下的肌肉发育研究中展现了应用价值，为相关疾病的体内研究开辟了可能性。