《Microchemical Journal》：LAMP-assisted electrochemical DNA biosensor for extraction-free detection of HPV-16 from cervical cancer cell lysates
编辑推荐：
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通过集成DNA生物传感技术对LAMP扩增子进行电化学检测。
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无需提取即可从粗宫颈细胞裂
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通过集成DNA生物传感技术对LAMP扩增子进行电化学检测。
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无需提取即可从粗宫颈细胞裂解物中检测HPV-16 E7。
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利用甲基蓝信号关闭策略实现灵敏的杂交读数。
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无需DNA纯化即可实现0.852 fM的超低检测限。
引言
人乳头瘤病毒（HPV）是一组无包膜的双链DNA（dsDNA）病毒，包含超过220种已知的基因型，主要通过性接触传播[1]，[2]。根据其致癌潜力，HPV被分为高风险（HR-HPV）和低风险（LR-HPV）类型，前者与多种癌症相关。全球每年大约有604,127例宫颈癌病例[3]，其中大多数发生在撒哈拉以南非洲、亚洲和拉丁美洲等资源有限的国家[4]。宫颈癌占女性所有癌症病例的约8.6%，是全球第四大常见癌症类型[3]。研究表明，几乎所有宫颈癌病例都存在HPV，其中高风险基因型HPV-16单独导致了约55.2%的病例[3]。
HPV感染通常无症状；然而，当病毒基因组整合到宿主细胞后，感染可能会持续存在并引发癌前宫颈上皮细胞的改变[6]。高风险HPV（包括HPV-16）编码如E6和E7等致癌蛋白，这些蛋白在宫颈癌发生过程中起关键作用。这些病毒致癌蛋白干扰宿主细胞中的关键肿瘤抑制途径。特别是E7蛋白与视网膜母细胞瘤（pRB）肿瘤抑制因子家族成员结合，从而阻止转录因子的抑制，导致细胞周期失控。通过破坏pRB的功能，E7改变上皮细胞的周期调节，促进恶性转化和不受控制的细胞增殖[7]，[8]，[9]。因此，鉴于其强烈的致癌潜力，HPV-16被认为是与宫颈癌发展相关的首要公共卫生威胁之一[10]。
为预防和诊断HPV而实施的疫苗接种和筛查策略有潜力显著降低全球宫颈癌发病率[11]，[12]。目前，已有三种HPV疫苗获得FDA批准，其中9价疫苗"Gardasil 9"被广泛推荐使用[13]，[14]。然而，尽管疫苗接种计划有效，但由于经济和基础设施的限制，其在许多低收入和中等收入国家的推广仍然有限。因此，开发快速、成本低廉且高度敏感的早期HPV检测方法仍然至关重要。特别是能够检测早期感染阶段低浓度HPV-16 DNA的方法对于提高早期诊断率和减少与HPV相关的癌症死亡率至关重要。
在病毒性疾病的早期诊断中，特定DNA序列的检测起着核心作用[15]，[16]，[17]。电化学传感技术的进步表明，生物传感器可以提供简单、经济实惠、易于微型化、高度选择性和灵敏的分析工具，用于检测病原体和癌症生物标志物[18]，[19]，[20]。在这些方法中，使用DNA探针作为捕获-识别元件的电化学DNA生物传感器因其稳定性、选择性和灵敏度而受到广泛关注[21]，[22]，[23]。然而，电化学DNA生物传感器中微尺度电极的使用常常存在灵敏度较低的问题。本研究中使用的铅笔石墨电极（PGEs）因其优异的电化学性能、低成本和易用性而受到青睐[24]，[25]，[26]，[27]。通过用功能性纳米材料修饰电极表面可以提高电化学生物传感器的性能。功能性纳米材料的加入可以改善电荷传输效率，并提供更大的表面积用于固定生物分子识别元件[28]，[29]，[30]。导电聚合物如纳米结构多芳基吡咯（PPy）由于高电导率、环境稳定性和支持生物分子固定的能力，成为生物传感器开发的理想材料[31]，[32]。
在感染早期阶段，由于目标分子通常浓度很低，可靠地识别病毒核酸具有挑战性。为了克服这一限制，常用核酸扩增方法。其中，环介导等温扩增（LAMP）是一种在恒定温度（55–65°C）下使用四种序列特异性引物扩增目标DNA的技术。通过添加额外的环引物，可以进一步加速扩增过程[33]，[34]。与传统基于PCR的方法相比，LAMP具有多个优势，包括无需复杂热循环设备即可实现等温扩增，并且对粗生物样品中的抑制剂具有更好的耐受性[33]，[35]。这些特性使得LAMP特别适合于无需提取的核酸检测策略，可以直接从最小程度处理的细胞裂解物中进行扩增。因此，基于LAMP的平台已成为快速诊断和分散式检测的有前景的工具[35]。
早期诊断HPV感染并鉴定临床样本中的病毒基因型可以显著降低死亡率，从而及时发现宫颈癌。尽管电化学生物传感器在HPV检测方面取得了进展，但许多已报道的系统仍然依赖于纯化的DNA样本，并涉及相对复杂的分析工作流程[36]，[37]，[38]，[39]。在这方面，我们开发了一种集成LAMP的DNA生物传感器，针对HPV-16 E7致癌基因，利用电化学方法实现高效检测。电极表面经过PPy纳米膜修饰以增强电化学性能，而生物素化捕获探针的固定稳定性则通过碳二亚胺介导的表面活化后的抗生物素-生物素相互作用得到加强。使用设计的目标寡核苷酸进行了优化研究，以提高生物传感器的分析性能。在扩增步骤中，将LAMP方法应用于热裂解的HPV-16阳性癌细胞，实现了无需DNA纯化的有效扩增。使用电活性指示剂甲基蓝（MB）监测LAMP扩增子与捕获探针之间的相互作用，并通过差分脉冲伏安法（DPV）进行评估。
尽管先前的研究已经证明将LAMP扩增与电化学生物传感器结合用于HPV检测的可行性，但大多数报道的方法仍然依赖于纯化的核酸和/或需要额外的扩增后处理（如热变性）以促进探针的的有效杂交。这些额外步骤增加了检测的复杂性，降低了此类平台在快速即时检测应用中的适用性。在本研究中，我们开发了一种基于PPy/PGE的电化学DNA生物传感器，能够直接检测从热裂解的宫颈癌细胞中产生的HPV-16 LAMP扩增子，无需DNA提取或扩增后的热变性。通过靶向天然LAMP扩增子中的结构可及区域，所提出的方法简化了分析工作流程，同时保持了高分析灵敏度、选择性和操作稳定性。因此，这种方法代表了向简化分子诊断和未来即时检测应用迈出的实际一步。因此，本研究的目的是开发一种基于LAMP的电化学DNA生物传感器，用于快速、灵敏且无需提取地直接检测热裂解的宫颈癌细胞裂解物中的HPV-16 E7。
部分片段
化学品
吡咯（Py；98%）、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；98%）、抗生物素和牛血清白蛋白（BSA；≥98%）购自Sigma-Aldrich（美国）。PGEs（长度6 cm，直径0.7 mm）使用从Tombow（日本）购买的2B石墨电极制备。Bst 2.0 WarmStart? DNA聚合酶、脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物和50 bp DNA梯形购自New England Biolabs（美国）。HPV-16阳性宫颈癌细胞系...
PPy/PGE的制备和表征
PPy是一种导电聚合物，其电化学性能受周围化学环境的影响很大。本研究选择PPy是因为其易于合成[31]，[43]，[44]，[45]，环境稳定性高，以及高电导率。对Py单体施加特定电压可生成Py阳离子自由基，这些自由基随后结合形成二聚体。重复这一过程会导致...
结论
本研究成功开发了一种基于PPy/PGE的电化学DNA生物传感器，用于敏感检测与宫颈癌相关的主要高风险HPV基因型之一的HPV-16。该生物传感器结合了LAMP扩增和电化学检测，通过甲基蓝信号关闭策略实现了0.852 fM的超低检测限、优异的选择性和长期稳定性。
该平台的一个主要优势是其能够...
CRediT作者贡献声明
Elif Günay：撰写 – 原稿、方法学、研究、数据分析、概念化。 Sabriye Percin Ozkorucuklu：撰写 – 审阅与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争财务利益或个人关系。
致谢
本研究由伊斯坦布尔大学科学研究项目协调单位资助。项目编号：FDK-2024-40729。作者EG还感谢土耳其科学技术研究 Council (TüB?TAK) 和国家博士奖学金计划（2211-A）。作者感谢伊斯坦布尔大学生物系的Gizem Akman讲师提供用于本研究的HeLa细胞。作者还感谢?eyda Günay的宝贵帮助...
