: 代谢功能障碍相关脂肪性肝病中基于细胞外囊泡的miRNA谱分析：MULTISITE临床试验的二次分析

《Journal of Extracellular Biology》：Extracellular Vesicle-Based miRNA Profiling in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease: A Secondary Analysis of the MULTISITE Clinical Trial

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球肝脏相关死亡的主要原因，在肥胖人群中的患病率为75%，且缺乏筛查工具。基于细胞外囊泡（EVs）的微小RNA（miRNA）已成为具有前景的生物标志物，在MASLD的发病机制中发挥重要作用。研究人员旨在表征肥胖伴MASLD患者减重干预前后的基于EV的miRNA谱。研究人员使用小RNA测序对三组血浆中的EV-miRNA进行了谱分析：肥胖伴MASLD患者（n = 35）、不伴肝脂肪变性的肥胖者（n = 24）以及不伴肝脂肪变性的瘦弱对照组（n = 26）。此外，MASLD组接受了个体化减重干预。在基线时，与肥胖对照组相比，MASLD组中肝脏和MASLD相关的miR-122-5p以及其他三种miRNA存在差异表达。此外，miR-122-5p在基线时与肝脏脂肪和肝脏酶（ALT、AST和GGT）相关，在联合模型中显示出对MASLD的可靠预测性（AUC = 0.8），最后在识别所有肥胖个体中高肝脏脂肪的人群时表现出最高的准确性。最后，在MASLD组中，经过减重和肝脏脂肪减少后，几种与MASLD和肝细胞癌相关的miRNA显著下降。

研究背景方面，自1980年以来，全球肥胖患病率翻了一番，影响近三分之一的世界人口。肥胖是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，一种与代谢危险因素密切相关的脂肪肝疾病）的主要风险因素，在肥胖人群中的患病率高达75%。MASLD可进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH，伴有炎症的脂肪性肝病）、肝纤维化和肝硬化，并增加患2型糖尿病（T2D）、心血管疾病（CVD）和肝细胞癌（HCC，肝脏原发性恶性肿瘤）的风险。目前，肝脂肪变性的诊断仅限于肝活检或磁共振成像（MRI，利用磁场生成体内详细图像的检查），两者均因侵入性高风险或成本高昂、耗时过长而不适用于人群筛查。微小RNA（miRNA，在转录后调节基因表达的小非编码RNA）能够修饰与MASLD发病机制相关的多种生物学功能。此前研究发现循环miRNA可能与MASLD相关，但循环miRNA的分析易受蛋白质、脂质和红细胞等成分影响。相比之下，源自细胞外囊泡（EVs，细胞释放的纳米级膜囊泡）的miRNA更稳定且更富集，是更具潜力的生物标志物候选者。EVs在细胞间通讯、诱导肝细胞凋亡及MASLD发病机制和进展中发挥关键作用。为解决MASLD早期非侵入性诊断工具缺乏的问题，研究人员开展了基于EV的miRNA谱分析研究，旨在肥胖及MASLD人群中评估减重干预前后的miRNA表达变化，探索其作为早期诊断生物标志物的潜力。该研究表明特定的EV-miRNA谱在肥胖伴MASLD患者中存在差异，并在减重干预后发生改变，miR-122-5p等表现出良好的诊断和预测效能，为MASLD的非侵入性早期诊断提供了潜在的新途径。该研究发表在《Journal of Extracellular Biology》。

在关键技术方法方面，样本队列来源于丹麦奥尔堡大学医院完成的MULTISITE临床试验。研究人员对血浆样本进行了EV富集与表征，包括使用纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白质印迹法和免疫电子显微镜（IEM）验证EVs。随后采用小RNA测序技术对三组参与者的血浆EV-miRNA进行谱分析，并对MASLD组进行为期5个月的个体化减重干预纵向随访。数据分析采用负二项线性模型和DESeq2包进行差异表达分析，利用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）进行功能分析，并通过留一交叉验证（LOOCV）和生成式人工智能（GAI）合成数据增强构建并评估生物标志物模型。

研究结果部分：
富集EVs的表征
研究人员通过NTA、蛋白质印迹和IEM分析，确认了分离的EVs富集了小囊泡，并表达Flot-1、CD63和CD9等标记物，且脂蛋白污染显著降低。
MASLD与肥胖对照组中miRNA表达模式的差异
通过小RNA测序和差异表达分析，研究发现与肥胖对照组相比，MASLD组在基线时miR-122、miR-185和miR-146b显著上调，而miR-10a显著下调。此外，在MASLD组与瘦弱对照组的比较中，miR-122显著上调，miR-10a显著下调。
MASLD组减重干预期间差异表达miRNAs的减少
通过纵向配对分析MASLD组干预前后的miRNA表达水平，研究人员发现在减重干预期间，从基线到1个月，miR-191、miR-335和miR-26a显著降低，而miR-451a和miR-337显著升高。从基线到5个月，miR-191、miR-335、miR-26a和miR-151a显著降低，miR-451a显著升高。
MASLD组中MASLD和HCC相关miRNAs的鉴定
通过手动检索数据库及靶基因网络分析，研究发现多种差异表达的miRNA与MASLD或NAFLD及HCC相关。GO和KEGG分析表明，这些miRNA的靶基因涉及细胞器建立、蛋白质定位以及胰岛素抵抗（IR）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等过程。
MiR-122与肝脏脂肪含量和肝脏酶类的相关性
通过线性回归分析，研究发现miR-122的表达水平与肝脏脂肪含量（R² = 0.19, p < 0.01）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）（R² = 0.44, p < 0.000001）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）（R² = 0.3, p < 0.001）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）（R² = 0.12, p < 0.05）呈正相关，与高密度脂蛋白（HDL）胆固醇（R² = 0.16, p < 0.05）呈负相关。miR-10a与HDL胆固醇（R² = 0.12, p < 0.05）呈正相关。
联合miRNA模型比单一miRNA具有更好的区分能力
通过逻辑回归分析和LOOCV等生物标志物分析发现，联合miRNA模型1在所有肥胖个体中对MASLD的预测表现优于单一miRNA，曲线下面积（AUC）达到0.80。在识别肥胖人群中的高肝脏脂肪含量方面，miR-122表现出最高的预测能力。此外，基于高肝脏脂肪与低肝脏脂肪组的差异表达分析构建的联合模型2和3在识别高肝脏脂肪含量方面表现出良好的区分能力，其中模型2的受试者工作特征曲线下面积（AUROC）达到0.89。

讨论与结论部分：
研究人员总结道，本研究确定了与肝脏及MASLD相关的miR-122-5p以及其他三种miRNA在MASLD组中相较于肥胖对照组存在差异表达。此外，miR-122-5p与所有肥胖个体的肝脏脂肪含量和肝脏酶显著相关。联合miRNA模型1显示出良好的MASLD预测能力，而模型2和3对所有肥胖个体中的高肝脏脂肪含量具有良好的区分能力。最后，本研究发现在个体化减重干预期间，几种与MASLD和HCC相关的miRNA显著减少，从而为MASLD诊断的非侵入性基于EV的生物标志物提供了明确的临床潜力。研究指出，miR-122在MASLD早期升高并随着疾病进展而下降，尽管减重干预显著改善了临床参数，但这些变化可能先于基于EV的miR-122表达变化。虽然本研究受限于样本量相对较小及缺乏减重对照组等因素，且脂蛋白与EVs共分离是技术上的固有局限，但该研究作为早期生物标志物发现分析，明确了EV-miRNAs在MASLD非侵入性诊断及干预监测中的重要价值。