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摘要译文：越来越多的证据表明，中枢神经系统（CNS）并非与外周免疫系统相互隔绝；然而，适应性免疫系统究竟如何监视CNS仍是一个关键问题。近期研究揭示，颅骨与硬脑膜之间的通道在小鼠稳态和疾病条件下均能促进脑脊液和免疫细胞在CNS与颅骨骨髓之间的交换1,
摘要译文：越来越多的证据表明，中枢神经系统（CNS）并非与外周免疫系统相互隔绝；然而，适应性免疫系统究竟如何监视CNS仍是一个关键问题。近期研究揭示，颅骨与硬脑膜之间的通道在小鼠稳态和疾病条件下均能促进脑脊液和免疫细胞在CNS与颅骨骨髓之间的交换1,2,3,4,5,6。颅骨骨髓是CNS免疫细胞的来源之一5，但其在CNS抗原特异性适应性免疫应答中的作用仍不清楚。本研究在颅骨骨髓内鉴定出淋巴结构，这些结构具有生发中心样形态，并含有一群独特的滤泡辅助性T样细胞，这些细胞通过CD40L、IL-21和IFNγ信号促进B细胞活化和体液免疫。颅骨骨髓淋巴结构内的适应性免疫细胞能够监视并对CNS来源的抗原作出应答，并在小鼠脑癌模型中参与抗肿瘤免疫应答。综上，研究结果表明颅骨骨髓是CNS免疫监视的位点，可能影响多种神经系统疾病中的免疫应答。
论文解读
一、研究背景与科学问题
长期以来，中枢神经系统（central nervous system, CNS）一直被视为免疫豁免部位，认为其与外周免疫系统之间存在相对隔离。然而，越来越多的证据表明这种传统观念需要修正。近年来的研究发现，颅骨骨髓与硬脑膜之间通过骨性通道直接相连，脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）能够通过这些通道到达颅骨骨髓，这使得颅骨骨髓在解剖学上成为与CNS密切接触的免疫器官。此前的研究已经证实，颅骨骨髓是CNS及其边界区域免疫细胞的重要来源，在稳态和神经炎症或损伤条件下均可向CNS供应免疫细胞，包括发育中的和不成熟的B细胞以及髓系细胞。尽管骨髓作为初级淋巴器官已被熟知，但适应性免疫应答在特定条件下也可在骨髓内发生。成熟抗原提呈细胞（antigen-presenting cells, APCs）、T细胞和B细胞能够迁移至骨髓，并在其中遭遇抗原、形成细胞簇。然而，颅骨骨髓是否以及如何参与CNS抗原识别和免疫监视，此前尚未被阐明。这一问题的解答对于理解CNS免疫监视机制至关重要，也为脑肿瘤等神经系统疾病的免疫治疗提供了潜在的新靶点。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过一系列实验证明了小鼠颅骨骨髓中含有外周淋巴器官特征的细胞组分，APCs、T细胞和B细胞在这里形成具有生发中心（germinal centre, GC）样结构的细胞簇。这些颅骨淋巴结构在稳态和脑癌条件下均参与CNS免疫监视，通过调节这些结构的数量和活性，研究人员证明了它们对抗肿瘤免疫具有功能性贡献。该研究发表在《Nature》杂志上。
三、关键技术方法
研究人员主要运用了以下关键技术：第一，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术，包括10x Genomics平台，对小鼠颅骨和胸骨骨髓中的T细胞、B细胞和抗体分泌细胞进行了转录组分析，并利用公共数据集（GSE184766和GSE233304）进行了人类颅骨骨髓数据的验证分析；第二，流式细胞术和荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS），用于鉴定和定量分析免疫细胞亚群；第三，全组织免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）和共聚焦显微镜成像，结合组织透明化技术对颅骨骨髓中的淋巴结构进行可视化；第四，单细胞B细胞受体（B cell receptor, BCR）测序分析，用于评估克隆扩增和体细胞超突变；第五，多种基因工程小鼠模型，包括IL-21-VFP报告小鼠、Il21r基因敲除小鼠、AID-Ai14报告小鼠、OT-II和MD4转基因小鼠、LTA缺陷小鼠和Aqp4缺陷小鼠等；第六，腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导的抗原表达系统，用于在神经元中表达模型抗原卵清蛋白（ovalbumin, OVA）和鸡卵溶菌酶（hen-egg lysozyme, HEL）-OVA；第七，小鼠脑肿瘤模型，包括CT2A胶质瘤细胞系和表达HEL-OVA的CHELLO细胞系。实验使用了8周龄雄性C57BL/6J小鼠，以及无菌（germ-free, GF）小鼠和喂食无抗原（antigen-free, AF）饮食的小鼠。
四、主要研究结果
（一）颅骨骨髓中TFH细胞的存在
研究人员通过比较小鼠颅骨骨髓与其他部位骨髓的T细胞表型发现，颅骨骨髓中中央记忆T细胞的比例高于其他骨髓部位。利用10x scRNA-seq分析鉴定出多种CD4+ T细胞亚群，其中值得注意的是表达Pdcd1、Cxcr5、Bcl6和Il21等基因的滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells, TFH）。通过IL-21-VFP报告小鼠的流式细胞术分析，研究证实了IL-21+CXCR5+ TFH细胞是骨髓中的一个独特亚群，且颅骨骨髓中TFH细胞的比例高于其他骨髓部位。全组织共聚焦成像显示，TFH细胞在颅骨枕部和顶间区域的骨髓中与B细胞形成细胞簇，而额骨和顶骨骨髓以及胸骨骨髓中这些细胞则较为罕见。对人类颅骨骨髓公共scRNA-seq数据的分析也支持TFH样细胞的存在。
（二）颅骨骨髓中B细胞的激活
基于颅骨骨髓中TFH细胞数量较多这一观察，研究人员假设颅骨骨髓可能表现出比其他骨髓部位更强的B细胞应答。对公共scRNA-seq数据集的分析鉴定出一个颅骨骨髓特异性细胞簇，该细胞簇在胫骨骨髓中不存在。对小鼠颅骨和胸骨骨髓的B细胞和抗体分泌细胞（antibody-secreting cells, ASCs）进行scRNA-seq分析，发现了表达GC相关特征基因和ASC特征基因的细胞簇，该细胞簇表达的免疫球蛋白已发生类别转换，但缺乏记忆标志物。进一步聚类分析鉴定出四个亚群：Epcam+浆细胞（plasma cells, PCs）、Tigit+ PCs、浆母细胞（plasmablasts, PBs）和GC样B细胞。颅骨骨髓中GC和ASC簇的细胞比例高于胸骨骨髓。流式细胞术和AID-Ai14报告小鼠分析证实，颅骨骨髓中GC样B细胞和ASCs比其他骨髓部位更丰富。
（三）TFH细胞促进颅骨骨髓中B细胞的活化
为评估TFH细胞是否支持颅骨骨髓中B细胞的经典活化和分化，研究人员首先用抗体清除CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。CD4+ T细胞清除导致颅骨骨髓中ASC分化显著减少，而CD8+ T细胞清除无显著影响。Il21r缺陷小鼠的颅骨骨髓中GC样B细胞和ASCs减少，而总B细胞和其他免疫细胞不受影响。全身性CD40L中和抗体处理可减少GC样B细胞。研究人员还开发了一种局部给药方法，将含抗CD40L抗体的水凝胶皮下注射至头皮下方，该抗体优先结合颅骨骨髓中的TFH细胞，特异性减少了颅骨骨髓中的GC样B细胞和ASCs，而不影响胸骨骨髓、硬脑膜和脾脏中的这些细胞。这些结果表明TFH细胞在颅骨骨髓内支持B细胞活化和分化。
（四）颅骨骨髓中的淋巴结构
研究人员通过共聚焦成像观察到，B细胞与APCs和T细胞形成的细胞簇主要分布在颅骨骨髓的后部区域，即枕骨和顶间骨区域。T-B细胞双联体分析证实颅骨骨髓中T-B细胞相互作用比胸骨骨髓更频繁，且这些双联体表达FAS和IL-21R。研究还发现这些结构中存在多种GC组分：B细胞趋化因子CXCL13和B细胞激活因子（BAFF）在细胞簇内共定位；存在表达S1PR2的B细胞簇；AID-Ai14报告小鼠确认了GC样结构的存在；在B细胞富集区域观察到了滤泡树突状细胞（follicular dendritic cells, FDCs），流式细胞术证实颅骨骨髓含有FDCs而其他骨髓部位没有。单细胞BCR测序分析显示GC样B细胞和ASCs表现出克隆扩增和体细胞超突变。GC样B细胞在出生后第7天就已大量存在，1岁龄小鼠中总GC样B细胞百分比未增加，但ASCs在颅骨和胸骨骨髓中均增加。
（五）颅骨骨髓中的抗原特异性应答
为研究激活颅骨淋巴结构的抗原，研究人员比较了SPF、GF和GF+AF饮食小鼠。GF和AF小鼠中颅骨骨髓的IgA+ ASCs和GC样B细胞减少，但仍保留一部分GC样B细胞，且IgG+和IgM+ ASCs不受影响，提示剩余的GC样B细胞可能针对自身抗原。为验证这一假设，研究人员使用AAV系统在神经元中表达模型抗原。通过AAV-hSyn-OVA-mCherry-P2A-eGFP的示踪实验，证实脑源性抗原可以通过生理性淋巴途径到达颅骨骨髓。OVA-mCherry在颅骨骨髓中被检测到，其中枕部骨髓信号最强。将OT-II CD4+ T细胞和MD4 B细胞过继转移后，神经元表达的HEL-OVA在颅骨骨髓中特异性激活了OT-II细胞并促进其向TFH细胞分化，MD4 B细胞也表现出更多的GC标志物表达。肿瘤模型中，CHELLO（表达HEL-OVA的CT2A胶质瘤细胞）移植后，过继转移的OT-II和MD4细胞在颅骨骨髓中数量和活化标志物表达显著增加，且优先定位于后部颅骨骨髓。CT2A胶质瘤移植增加了颅骨骨髓中GC样B细胞的数量，但不影响胸骨骨髓、深颈淋巴结（deep cervical lymph nodes, dCLNs）、脾脏和脑中的这些细胞。研究还通过dCLN结扎手术和脾切除的LTA缺陷小鼠证实，颅骨淋巴结构中的免疫应答可以不依赖于次级淋巴器官（secondary lymphoid organs, SLOs）独立发生。此外，Aqp4缺陷小鼠中抗原摄取和抗原特异性应答受损，提示脑内类淋巴系统（glymphatic system）驱动的抗原外排对于颅骨淋巴结构应答是必需的。
（六）抗肿瘤免疫
研究人员用含抗CD40L抗体的水凝胶皮下递送部分阻断颅骨淋巴结构，发现CT2A荷瘤小鼠的生存期显著缩短，伴随淋巴细胞浸润减少和瘤内CD8+ T细胞活化降低。为探索颅骨骨髓淋巴结构的治疗潜力，研究人员开发了三联疗法：局部联合应用CD40激动剂抗体、IL-21和IFNγ。局部递送三联疗法可增强颅骨骨髓中的淋巴应答而不影响其他组织，并显著延长CT2A荷瘤小鼠的生存期。三联疗法在B细胞缺陷的muMT小鼠和ASC缺陷的Jchain-DTA小鼠中无效，表明其疗效依赖于B细胞和ASC的抗体应答。三联疗法还增强了瘤内微小胶质细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞和CD8+ T细胞的抗肿瘤应答，同时减少了抑制性免疫细胞，如调节性B细胞和调节性T细胞的IL-10表达。
五、讨论与结论
研究发现了颅骨骨髓中的功能性淋巴结构，包含TFH细胞、FDCs和GC样结构。这些结构能对CNS来源的抗原作出应答，并在无疾病状态和脑肿瘤模型背景下引发抗原特异性适应性免疫应答，从而参与CNS免疫监视。颅骨骨髓作为初级淋巴组织，为脑及其边界区域提供免疫细胞，同时颅骨骨髓中存在的淋巴结构使其具有独特的适应性免疫应答能力。TFH细胞通过细胞因子和共刺激分子促进组成性B细胞活化，这一活性可能由通过骨性通道经CSF持续输送至颅骨骨髓的CNS来源抗原所维持。脑源性抗原到达颅骨骨髓的过程依赖于类淋巴途径而非手术泄漏，且颅骨骨髓中的淋巴结构是对脑源性抗原的最早应答者之一。在SLO功能受损的情况下，颅骨骨髓中的免疫应答仍可发生，表明颅骨骨髓提供快速免疫应答可能得益于其与CNS的解剖学邻近性，而外周免疫区室可能在后期阶段放大和维持这些应答。研究结果还提示，人类颅骨骨髓中TFH样细胞的存在支持了这些发现与人类生物学的潜在相关性。结论部分指出，该研究鉴定了颅骨骨髓中支持CNS抗原特异性免疫应答的功能性淋巴结构，表明颅骨骨髓代表CNS边界处的适应性免疫生态位，可能为神经免疫相互作用提供见解，并为脑肿瘤和其他神经系统疾病的未来治疗策略提供信息。
