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长时间觉醒会增加睡眠驱力（sleep drive），并且通常通过增加睡眠来补偿。这种睡眠的稳态调节深刻影响我们的生活，但其背后的神经回路机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员利用全脑活动图谱（whole-brain activity mapping）、靶向神经元
长时间觉醒会增加睡眠驱力（sleep drive），并且通常通过增加睡眠来补偿。这种睡眠的稳态调节深刻影响我们的生活，但其背后的神经回路机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员利用全脑活动图谱（whole-brain activity mapping）、靶向神经元操控和电生理学方法，鉴定了小鼠中调控睡眠驱力的觉醒激活神经元。通过比较睡眠剥夺、恢复性睡眠和昼夜节律行为期间的全脑反应，研究人员将前内侧视前区（anterior medial preoptic area, aMPO）和中缝核（median raphe, MR）确定为编码睡眠亏欠的候选脑区。激活这些区域中响应睡眠剥夺的细胞，可诱导睡眠时长和强度的增加，类似于恢复性睡眠。相反，抑制这些响应剥夺的细胞会减少睡眠，并消除通常在剥夺期间观察到的睡眠倾向增加。中缝核中响应睡眠剥夺的神经元投射到皮层下睡眠相关区域，并通过视前区下丘脑发挥作用。这些对剥夺敏感的细胞包括血清素能神经元和一群独特的GABA能神经元，其内在兴奋性在睡眠剥夺期间增加。GABA能神经元和血清素能神经元的共同激活协同促进睡眠，而共同抑制则使睡眠慢性减少近70%。值得注意的是，尽管睡眠显著减少，大多数小鼠仍然存活，且未出现通常与严重睡眠剥夺相关的睡眠驱力代偿性增加或行为缺陷。总之，这些结果定义了在觉醒期间被激活且对睡眠驱力至关重要的神经元群体。
长时间觉醒会导致睡眠驱力增加，随后通过补偿性睡眠来恢复。然而，驱动这种稳态调节的神经回路机制仍不清楚。既往研究虽已鉴定出调节睡眠和觉醒的广泛神经网络，但产生强烈睡眠冲动的机制仍是个谜。为此，研究人员开展了本研究，旨在鉴定编码睡眠驱力的特异性神经元群体。该研究发表于《Nature》。研究人员通过全脑FOS免疫染色与光片成像、靶向神经元操控、电生理记录等方法，发现前内侧视前区（anterior medial preoptic area, aMPO）和中缝核（median raphe, MR）是编码睡眠亏欠的关键区域，并进一步解析了其中GABA能和血清素能神经元对睡眠驱力的调控作用。
关键的技术方法包括：使用iDisco组织透明化和MesoSPIM光片显微镜进行全脑FOS成像，并利用SHIELD流程将数据配准到标准小鼠脑图谱；使用TRAP2（Fos-2A-iCreERT2）小鼠进行剥夺-TRAP标记以捕获睡眠剥夺激活的细胞；通过立体定位注射Cre依赖性病毒载体实现化学遗传学激活（hM3Dq）或抑制（hM4Di、PSAM4-GlyR）以及Kir2.1介导的慢性沉默；采用顺行示踪（mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby）和逆行Flp/Cre交叉策略解析投射；结合脑电图（electroencephalogram, EEG）记录睡眠行为，并用全细胞膜片钳记录检测神经元内在兴奋性。研究使用的小鼠包括C57BL6/J、Sert-Cre、Vgat-IRES-Cre、Vglut2-IRES-Cre等品系，均来源于Jackson Laboratory。
**Brain responses to sleep deprivation and recovery**
通过比较睡眠剥夺、恢复期以及昼夜节律不同时间点的全脑FOS反应，研究人员识别出三类时空反应模式：早期峰值型（type 1）、睡眠相关型（type 2）和觉醒相关型（type 3）。type 3区域（包括aMPO和MR）在两种睡眠剥夺方式及自发觉醒中均持续激活，其激活程度随觉醒时长增加而升高，提示这些区域能反映睡眠亏欠。
**Deprivation-TRAP cells promote sleep**
利用TRAP2小鼠标记睡眠剥夺晚期激活的细胞（deprivation-TRAP），并在充分休息后的暗期起始进行化学遗传激活。激活MR或aMPO中的deprivation-TRAP细胞使非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement, NREM）时长和δ波（0.25–4 Hz）功率显著增加，表明这些细胞足以诱导类似于恢复性睡眠的深度睡眠。
**Deprivation-TRAP cells in normal sleep behaviour**
通过表达内向整流钾通道Kir2.1慢性抑制MR或aMPO的deprivation-TRAP细胞，小鼠24小时NREM睡眠减少，尤其暗期和光期初期睡眠时间缩短，觉醒片段延长且更集中；睡眠剥夺期间的睡眠尝试次数也显著减少，说明这些细胞对于正常睡眠驱力的累积是必需的。
**MR deprivation-TRAP cell projections**
顺行示踪显示MR deprivation-TRAP细胞广泛投射到后脑、中脑、海马、丘脑和下丘脑等多个皮层下睡眠相关区域，包括aMPO、外侧视前区（lateral preoptic area, LPO）和外侧下丘脑区（lateral hypothalamic area, LHA）。化学遗传激活MR deprivation-TRAP细胞可诱导靶区FOS双向变化：aMPO和LPO被激活，而LHA、中央杏仁核和外侧缰核被抑制。选择性激活投射到LPO的MR细胞足以促进NREM睡眠，提示MR通过激活睡眠效应区并抑制觉醒效应区来发挥促眠作用。
**GABAergic and serotonergic MR cells promote sleep**
荧光原位杂交和免疫染色显示，MR deprivation-TRAP细胞主要为Vgat
+（GABA能）或血清素
+神经元。化学遗传激活Vgat
+或Sert
+细胞均能增加NREM睡眠和δ功率，二者共同激活产生更强烈的协同促眠效应；而急性共同抑制则减少睡眠，并在睡眠剥夺期间几乎消除睡眠尝试。相反，激活Vglut2
+（谷氨酸能）细胞强烈促进觉醒，抑制则增加睡眠。这表明MR内的GABA能/血清素能神经元与谷氨酸能神经元在睡眠调节中发挥相反功能。
**Lack of sleep boosts MR GABAergic cell excitability**
全细胞膜片钳记录显示，6小时睡眠剥夺使MR GABA能神经元静息膜电位去极化、动作电位阈值降低，自发放电比例和频率增加，而血清素能神经元无明显变化。这表明睡眠剥夺特异性地增强MR GABA能神经元的内在兴奋性，从而使其在觉醒期间更易被激活并促进睡眠。
**Co-inhibition persistently changes sleep drive**
在Vgat-Cre;Sert-Cre双转基因小鼠的MR中表达Kir2.1，慢性共同抑制GABA能和血清素能细胞使NREM睡眠减少近70%，平均觉醒片段长度增加两倍以上，δ功率累积速率显著降低。在睡眠剥夺期间，这些小鼠不出现睡眠尝试，恢复期也无明显的反弹睡眠。这说明长期抑制这些细胞会持续降低生理和行为层面的睡眠驱力。
**Co-inhibition allows high-arousal wake maintenance**
慢性共抑制MR GABA能和血清素能细胞的小鼠中约17%因睡眠进一步减少而死亡，但大多数存活。行为学分析显示，存活小鼠运动量增加，但在旷场和高架十字迷宫中的焦虑样行为无显著变化；它们能维持对木块和新型物体的高水平互动，并在条件性恐惧记忆中形成持续至少14天的长期记忆，表明严重慢性睡眠减少在多数情况下不会导致严重的认知缺陷或睡眠驱力代偿性增加。
讨论部分指出，该研究的三个主要进展是：描绘了反映自发及诱导睡眠驱力变化的全脑活动图谱；确定了MR和aMPO中既能感知又能控制睡眠驱力的神经元群体；通过抑制MR GABA能和血清素能神经元，持久且大幅降低了睡眠驱力。与损伤睡眠促进系统或增强唤醒系统的操作不同，抑制MR/aMPO细胞并不增加睡眠压力，反而降低δ功率累积，提示这些细胞可能参与睡眠压力的累积而非睡眠执行本身。讨论还提出，MR deprivation-responsive神经元可通过广泛投射（如抑制LHA、激活LPO）偏向“翻转开关”模型中的睡眠状态，并通过丘脑等间接通路调节NREM振荡。睡眠剥夺增强MR GABA能细胞兴奋性可能涉及细胞自主和突触可塑性机制。
研究结论：这些结果定义了在觉醒期间被激活且对睡眠驱力至关重要的神经元群体，为进一步解析最终使睡眠不可避免的神经回路和分子机制提供了切入点。
