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人脑的发育和成熟过程极其漫长，跨越生命近二十年。调控人类出生后大脑发育的物种特异性方面的过程难以在动物模型中研究。虽然人脑类器官提供了一种有前景的体外模型，但迄今为止被证明主要模拟大脑发育的早期阶段。在此，研究人员在培养中发育人脑类器官长达5年，优化生长条件以
人脑的发育和成熟过程极其漫长，跨越生命近二十年。调控人类出生后大脑发育的物种特异性方面的过程难以在动物模型中研究。虽然人脑类器官提供了一种有前景的体外模型，但迄今为止被证明主要模拟大脑发育的早期阶段。在此，研究人员在培养中发育人脑类器官长达5年，优化生长条件以将兴奋性神经元的存活时间拓展至以往极限之外。利用源自内源人脑的成熟相关模块，研究人员表明脑类器官在培养多年中以细胞类型特异性的方式在转录水平上老化。全基因组甲基化分析显示，类器官的预测表观基因组年龄与体外度过的时间精确相关，并与体内表观基因组老化平行。值得注意的是，研究人员表明，在通过混合不同年龄神经祖细胞产生的嵌合类器官中，老年祖细胞迅速产生晚期神经元命运，跳过早期神经元后代的产生，从而表明在类器官中老化的祖细胞保留了对体外时间的记忆。这些数据表明，人脑类器官可以在培养中持续成熟并记录跨越数年的时间流逝。
人脑发育和成熟过程跨越近二十年，这一漫长的“幼态持续”（neoteny）特性是人类大脑高级认知功能形成的基础。控制人类出生后大脑发育的物种特异性机制难以在动物模型中复现。人脑类器官虽能在体外模拟神经发育，但以往培养时间仅数月，主要覆盖早期发育阶段，无法用于研究出生后成熟过程。因此，研究人员探究了能否将类器官培养延长至多年，并观察其是否能够记录时间流逝。研究人员建立了培养时间超过5年的人脑皮层类器官体系，优化生长条件使兴奋性神经元存活时间突破以往极限。通过整合单细胞转录组、全基因组甲基化、超微结构成像和电生理记录，他们发现类器官在培养过程中以细胞类型特异性的方式转录老化，其DNA甲基化年龄与培养时间精确相关，并类似体内表观遗传老化过程。更关键的是，嵌合类器官实验表明，已老化祖细胞能够“回忆”其在体外经历的时间，在受到年轻细胞信号诱导时跳过早期发育步骤，直接产生晚期神经元。该研究发表在《Nature》上，证明人脑类器官能在多年培养中持续成熟并记录时间。在技术方法上，研究人员利用长期类器官培养（5年）结合单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）分析110个类器官的424,720个细胞，这些类器官来自H1胚胎干细胞系和PGP1、11a、Mito210、GM08330等多个iPS细胞系；采用全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）分析DNA甲基化动态；使用多电极阵列（microelectrode array，MEA）记录自发神经活动；通过电子显微镜（electron microscopy，EM）和扩张显微镜（expansion microscopy）量化突触和神经元形态；并用混合不同年龄祖细胞构建嵌合类器官（chimeroid）来测试命运潜能。在结果部分，研究人员首先观察到“皮层类器官在培养中适当老化”。通过scRNA-seq时间序列和与内源人脑参考数据集的标签转移，发现类器官细胞的转录年龄从早期胎儿阶段逐渐过渡到出生后阶段；使用DIALOGUE算法识别的成熟模块评分与培养时间呈正相关。WGBS显示，类器官整体甲基化水平逐步上升并趋于稳定，与内源组织相似；应用Horvath和皮层特异性表观遗传时钟，预测的DNA甲基化年龄与培养时间高度相关（r=0.88和0.90）。这表明类器官能忠实地记录体内样式的老化过程。第二个小标题“活动允许培养基维持兴奋性神经元”。在传统CDM4培养基中，神经元比例随时间下降，但免疫染色和bulk RNA-seq仍能检测到神经元标志物。为改善神经元存活，研究人员采用以BrainPhys为基础的活动允许培养基（activity permissive medium，APM）。在APM中，9个月时SATB2+及SATB2+FOS+细胞显著增加；1年时突触密度和棘突比例升高；神经元形态复杂度（如总长度、分支数、Strahler数）显著提高。MEA记录显示，APM类器官在6、9、12个月均维持较高的放电率和网络爆发频率，甚至在2年时仍存在活跃网络，而CDM4类器官在1年时已无网络爆发。表明APM促进兴奋性神经元的长期存活和功能成熟。第三个小标题“祖细胞记录和回忆发育时间”。研究人员构建了小鼠和人类嵌合类器官。在人类实验中，将9–12个月龄的旧祖细胞与DIV15的年轻祖细胞混合（异时相嵌合），2周后，旧祖细胞产生大量CPNs（占49.0%），而年轻祖细胞仍产生早期细胞类型；单时相旧祖细胞则维持9个月龄的组成。这表明旧祖细胞保留了发育时间记忆，即使受年轻信号诱导，也会跳过早期步骤，直接生成晚期神经元。讨论部分强调，长期培养的类器官通过转录和DNA甲基化程序记录时间，并能回忆时间；自发活动对神经元成熟具有重要作用。结论翻译为：人脑类器官能够在培养中持续成熟并记录跨越数年的时间流逝；结合长期培养和所产生的多模态数据，为理解人脑幼态持续、成熟和进化的机制提供了强大的实验系统。
