超声辅助的选择性发酵技术提高了从微藻中提取脂质的效率

《Renewable Energy》：Ultrasound-enhanced selective fermentation improves lipid recovery from microalgae

　　

摘要

为了提高微藻细胞的破碎效率和多目标产物的回收率，本研究结合了预处理与选择性厌氧发酵技术，以微藻作为唯一底物。比较分析表明，NaOH预处理有利于生物气和挥发性脂肪酸（VFAs）的产量，而超声波预处理则提高了脂质的提取效率（产量和浓度），同时减少了降解程度，实现了能源和材料的平衡回收。通过响应面分析法确定的最佳超声波辅助发酵条件（4.4分钟、60微米振幅、10小时）可使脂质提取率达到总脂质的约80%。连续流评价显示，缩短停留时间后，每天产气量增加到4.4升，10小时时的脂质提取率达到83.36%。制备的生物柴油十六烷值大于60，符合EN（≥51）和ASTM（≥47）标准，其运动粘度、碘值和热值也符合要求。通过16S rRNA基因的高通量测序揭示了微生物群落的演变机制。这些研究结果表明，针对性的预处理技术能够提升脂质和生物能源的产量，解决基底利用不足的问题，为大规模微藻生物炼制厂生产生物柴油和其他高附加值生化产品提供了路径。

引言

微藻是最古老的光合生物之一，能够利用太阳能固定二氧化碳（CO?）并合成蛋白质、脂质、核酸等大分子有机物以及烷烃、醇和氢等可再生能源[1]。微藻可通过脂肪酸合成途径积累大量脂质，其脂质含量占细胞干重的5%-50%，在特定生长条件下甚至可高达80%，因此被视为第三代生物柴油的主要原料[2]。Anahas等人还发现微藻脂质中含有大量饱和脂肪酸，非常适合用于生物柴油的生产[3]。然而，微藻的多糖细胞壁和细胞外层多糖限制了生物量的转化和脂质的提取效率。因此，如何高效且低能耗地破坏微藻细胞壁成为当前研究的热点[4,5]。

选择性发酵破壁技术作为一种低能耗、低成本的厌氧发酵技术逐渐受到关注[6]。选择性发酵过程比普通厌氧发酵过程更为复杂，在该条件下，不同有机物的降解速率不同；当其他有机物被分解利用时，脂质可以大量保留。因此，探索影响碳水化合物和蛋白质高效降解的参数及时间节点，以及高效保留脂质的机制，已成为亟需解决的瓶颈问题。Lai等人[7]使用微藻（Scenedmus）进行了选择性发酵实验，结果表明在pH 5和pH 7条件下，碳水化合物的降解速度最快，其次是蛋白质，同时脂质得以保留。蛋白质和碳水化合物的发酵还产生了大量的挥发性脂肪酸（VFAs），并且不饱和脂肪酸甲酯（FAMEs）通过生物氢化转化为更理想的饱和脂肪酸甲酯。随后，Lai等人[6]进行了半连续选择性发酵实验，发现污泥停留时间（SRT）超过2天时，非脂质部分的VFAs产量提高了4倍，同时脂质得到保留，并通过生物氢化使FAMEs饱和。发酵作为一种破壁手段，不仅提高了脂质提取效率，还促进了酸、醇、H?等能源物质的生成。El-Dalatony等人[8]采用连续发酵技术破壁微藻：第一阶段进行碳水化合物发酵生产生物乙醇，第二阶段进行蛋白质发酵生产高级醇类，第三阶段将甘油三酯转化为生物柴油，通过连续过程最大化微藻生物组分的回收。

然而，微藻含有大量的复杂多糖、蛋白质和脂质，这使得其发酵产物的组成比常见底物的发酵产物更为复杂，导致发酵速率缓慢、基底利用率低等问题。因此，一些学者通过物理、化学等方法对微藻进行预处理以加速水解过程[9,10]。实验表明，用热碱预处理蓝藻后进行厌氧发酵，溶解化学需氧量（SCOD）、碳水化合物和蛋白质的含量分别增加了10.3倍、12.3倍和4.8倍，同时提高了蓝藻的生物可利用性，并减少了腐殖酸的含量，有利于后续生物转化。Sivagurunathan等人[11]研究了各种稀酸对海洋微藻（Gelidium amansii）的影响，发现用H?SO?预处理后碳水化合物的水解速率更快，产生的H?量是未处理组的 twice，但H?SO?处理的产气延迟时间较短。Ha等人[12]通过超声波预处理微藻后缩短了发酵时间，并利用微藻细胞中的碳水化合物、蛋白质和脂质生产多种生物燃料，实现了原料的高效利用。然而，微藻预处理的效果受多种因素影响，包括预处理技术、持续时间和强度的不同，这些因素也可能影响厌氧发酵的速度和容量。目前的微藻细胞破碎和预处理技术仍存在不足：微波预处理能耗高且易导致局部过热引起的脂质降解；酶法预处理依赖昂贵的酶，反应时间长且操作适应性差；超临界CO?预处理需要高压设备，初始投资和运行成本高，且只能单独提取脂质而无法同步利用碳水化合物和蛋白质组分。超声波耦合的选择性发酵方法温和、能耗低、经济高效且易于在大气压下操作，能选择性降解碳水化合物和蛋白质，有效保留脂质，并同时产生生物气体、氢气和挥发性脂肪酸，在能源消耗、组分利用和产品多样性方面具有较大优势，更适合大规模微藻生物炼制。

总之，选择性厌氧发酵为微藻的分级降解和协同生产提供了现实基础。将选择性发酵作为破壁技术与传统微藻预处理方法结合使用，有望进一步提高微藻细胞的破碎程度，从而提升发酵效率和脂质提取效果。在以往关于微藻生物柴油的研究中，很少有将选择性发酵与其他预处理方法结合的报告。例如，Park等人使用氢氧化钾预处理来增强脂质提取和转化[13]；Xing等人则直接采用选择性发酵处理微藻[14]。因此，在本研究中，以微藻为底物，结合多种预处理方法与选择性厌氧发酵技术（图1），在降解糖类和蛋白质的同时最大化脂质的保留，实现微藻的多目标生产能力，为生产H?和生物柴油等生物燃料提供了可能，并提高了厌氧发酵系统处理有机废物和能源回收的效率，具有广泛的应用前景。

章节摘录

材料与接种物

实验中使用的微藻为Nannochloropsis属，购自哈尔滨荣水产品有限公司。预处理前，Nannochloropsis属的总脂质含量为52.39%（干重基）。使用前反复清洗微藻以去除藻液中的其他干扰成分，藻液的初始pH值在6.8至7.0之间。

用于测试的好氧活性污泥购自利宝源环保有限公司。

不同预处理方法对发酵效果的影响

图2显示了不同预处理条件下总碳水化合物、蛋白质、SCOD、pH值、VFA和气体产量的变化。预处理提高了微藻的水解速率（图3a），尤其是在发酵开始的16小时内，所有实验组的碳水化合物降解迅速，其中NaOH处理组的降解速率最快，但对...

结论

本研究结合了三种预处理技术——NaOH、HCl和超声波——与选择性厌氧发酵技术，以提高微藻细胞的破碎效率，从而实现有效的脂质提取和微藻的协同生产能力。虽然超声波预处理在脂质提取方面表现最佳，并有助于H?的产生，但NaOH预处理在气体和VFAs生产方面更具优势。

作者贡献声明

Zheng Lu：概念构思、数据处理、数据分析、资金获取、研究设计、方法学研究、项目管理、初稿撰写、修订与编辑。Jiayi Huang：研究设计、方法学研究、项目管理、数据可视化、初稿撰写、修订与编辑。Chenxi Zhou：概念构思、研究设计、方法学研究、项目管理。Ruxian Wang：数据处理、数据分析、项目管理、软件应用、监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本手稿研究的财务利益或个人关系。

所有作者确认不存在任何利益冲突，包括但不仅限于就业、咨询、持股、报酬、专家证词、专利申请/注册以及可能与提交工作相关的资助或其他财务支持。

本研究在无...

致谢

感谢海洋负碳排放（ONCE）计划、中央高校基本科研业务费（3072025YC0302, 3072025YC0303）、山东省自然科学基金（ZR2023QE073）和黑龙江省自然科学基金（LH2023E070）的支持。

Zheng Lu|Jiayi Huang|Chenxi Zhou|Ruxian Wang|Yiyang Mao|Encai Tian|Jiadong Guo|Fan Li

哈尔滨工程大学能源与动力工程学院，哈尔滨，150000，中国