《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Engineered multicolor “Fluorescent Lantern” TEC-Fusion protein with tunable spectra enables multiplexed fluorescent labeling and biological imaging
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摘要传统的单色荧光标记技术在多参数成像中面临诸多限制，包括光谱重叠、组合标记的限制、荧光强度的变化、稳定性问题以及在不同实验条件下的光漂白抵抗能力，还有在高背景环境中的对比度不足。这些挑战阻碍了它们在复杂生物系统中进行高精度成像的能力。为了解决这些问题，研究人员设计并表征了一种新
摘要
传统的单色荧光标记技术在多参数成像中面临诸多限制，包括光谱重叠、组合标记的限制、荧光强度的变化、稳定性问题以及在不同实验条件下的光漂白抵抗能力，还有在高背景环境中的对比度不足。这些挑战阻碍了它们在复杂生物系统中进行高精度成像的能力。为了解决这些问题，研究人员设计并表征了一种新型的三色荧光融合蛋白TEC-Fusion，它由mTagBFP2、EGFP和mCherry组成。生物信息学预测和实验结果表明，TEC-Fusion具有均匀的颗粒大小、良好的亲水性和结构稳定性，计算模型还揭示了其潜在的“灯笼状”结构。光谱分析显示，三种荧光域在融合后仍保持独立的光学功能，TEC-Fusion的多光谱激发能力使其能够在七个可见光谱（蓝色、青色、绿色、黄色、红色、白色和品红色）下进行荧光成像，其中白色和品红色是之前未报道过的。在稳定性方面，TEC-Fusion表现出优异的pH耐受性、热稳定性和氧化耐受性，同时也具有良好的光稳定性。此外，TEC-Fusion在细胞水平、复合材料系统以及动物模型中均显示出良好的生物相容性和成像性能。总体而言，作为一种新型的多色荧光探针，TEC-Fusion在光谱多样性、稳定性和生物相容性方面具有显著优势，为多参数成像、生物传感器开发和药物递送追踪应用提供了新的工具。
引言
荧光蛋白（FPs）是一类具有光诱发光性质的生物大分子，其发光机制源于特定氨基酸残基通过自催化反应形成的发色团结构[1]，[2]。自1962年Osamu Shimomura的团队从Aequorea victoria中分离出绿色荧光蛋白（GFP）[3]以来，基因工程技术使得开发出覆盖整个可见光谱的荧光蛋白变体成为可能[1]。代表性的荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白（EBFP、mTagBFP、Azurite）[4]，[5]，青色荧光蛋白（ECFP、mCerulean）[6]，绿色荧光蛋白（EGFP、mEmerald、ZsGreen）[7]，[8]，黄色荧光蛋白（EYFP、mVenus、Ypet）[9]，橙色荧光蛋白（mOrange、mKO）[10]，[11]，以及红色荧光蛋白（mCherry、mStrawberry、TagRFP）[12]。它们的发光机制遵循斯托克斯位移原理：吸收高能量短波光子后进入激发态，通过非辐射衰变和构象松弛释放能量，最终发出低能量长波光子[13]。这一独特性质使它们成为体内标记的理想探针[14]。
基于荧光蛋白的成像技术的出现从根本上改变了现代生物科学[15]。在细胞生物学中，荧光蛋白作为细胞标记和追踪工具，能够实时观察细胞迁移、分化和细胞间相互作用等动态过程[16]，[17]。发育生物学家利用荧光蛋白追踪生物体发育过程中的细胞变化，为研究发育机制提供了重要的可视化方法[18]，[19]。在神经科学中，荧光蛋白有助于针对性地研究神经元，辅助解析神经网络的功能和可塑性[20]。除了基础研究外，这些蛋白质在临床医学、药物筛选和基因治疗中也显示出广泛的应用潜力，可作为报告基因监测基因表达水平，支持药物开发，并作为肿瘤识别和病理分析的成像工具[21]，[22]，[23]。随着技术的进步，荧光蛋白的应用不断扩展，已成为现代生物技术研究中不可或缺的工具。
尽管取得了这些进展，传统的单色荧光蛋白系统仍存在固有的局限性[24]，如在多重标记实验中的光谱重叠、组合标记的限制、荧光强度的变化、稳定性问题以及在不同实验条件下的光漂白抵抗能力，还有在高背景环境中的对比度不足[25]，[26]，[27]。虽然单色荧光蛋白对许多应用仍然至关重要，但这些缺点促使人们探索更复杂的标记系统，如多色荧光蛋白和串联荧光蛋白，以克服这些限制。
为了突破这些限制，本项目旨在通过三种光谱迥异的荧光蛋白的串联融合来构建一种新型的三色荧光蛋白。借鉴球蛋白结构域组装策略，分子设计采用了灵活的连接肽将蓝色荧光蛋白mTagBFP2、绿色荧光蛋白EGFP和红色荧光蛋白mCherry连接成一个单一的转录单元。基于AlphaFold预测的模型（该模型呈现“灯笼状”结构），我们将这一构建体命名为“Fluorescent Lantern”。每个蛋白质组分在实现整体功能的同时保持相对独立性，在不同的激发波长下发出三种不同的荧光信号。这种设计使得在单次实验中可以同时观察三种荧光信号，减少了光谱重叠和背景干扰，促进了多重标记及多个生物过程的监测。
章节片段
材料和试剂
分子克隆载体pET-24a(+)和表达宿主大肠杆菌 BL21 (DE3)购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。硫酸卡那霉素和异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。人宫颈癌细胞系HeLa由中国科学院类型培养委员会提供（中国上海）。细胞培养试剂包括胎牛血清（FBS）、Dulbecco's Modified
TEC-Fusion蛋白的表征和结构分析
使用ExPASy套件分析了TEC-Fusion蛋白的理化性质。该蛋白由735个氨基酸组成，理论分子量为81.6 kDa，预测pI值为6.08。在20种常见氨基酸中，带负电荷的（Asp+Glu）和带正电荷的（Arg + Lys）残基数分别为98和84。甘氨酸是最丰富的氨基酸，而半胱氨酸和色氨酸是最少的。不稳定性指数计算值为31.36，
讨论
尽管传统的单色荧光蛋白标记技术能够有效追踪特定生物分子，但其局限性也越来越明显。一方面，这些蛋白质只能提供单一颜色的信息；要同时追踪多个分子，需要多种不同颜色的荧光蛋白，然而它们的光谱严重重叠，使得精确的多参数成像变得困难[30]。另一方面，它们的发射
结论
在这项研究中，成功构建并系统地表征了一种新型的多激发荧光蛋白TEC-Fusion。该蛋白具有稳定的结构、多样的光谱特性、强的环境适应性和优异的生物相容性。这是首次使用单一荧光蛋白实现白色荧光成像。作为一种创新的多激发荧光蛋白，TEC-Fusion在荧光成像等领域展现出广泛的应用前景
CRediT作者贡献声明
刘迪：概念构思、方法学设计、撰写及编辑、资金获取。曲佳琪：数据管理、正式分析、验证、初稿撰写。王千成：验证。乔鸿平：指导、项目管理。张艺丽：数据可视化。李娜：正式分析。齐金山：资源协调。李波：资源支持。吴晓颖：资源协调、资金获取。
机构审查委员会声明
动物实验方案得到了太原师范学院生物科学与技术学院动物伦理委员会的批准，方案编号为TYNU-SKY-2025-011。本研究严格遵守了委员会的指导原则。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了山西省基础研究计划（20210302123317）和现代农业科技研究体系专项基金（2025CYJSTX18）的支持。
刘迪|曲佳琪|王千成|乔鸿平|张艺丽|李娜|齐金山|李波|吴晓颖
太原师范学院生物科学与技术学院及兽医学中心，中国山西省晋中030619
