协调分子持久性与功能恢复：一种混合四层计算模型用于研究肉毒杆菌神经毒素A

《Toxicon》：Reconciling Molecular Persistence and Functional Recovery: A Hybrid Four-Layer Computational Model of Botulinum Neurotoxin A

　　摘要
肉毒杆菌神经毒素A型（BoNT/A）通过受体介导的摄取、轻链转移和SNAP-25切割产生化学去神经作用，但其分子持久性和临床恢复可能在不同时间尺度上发生。我们构建了一个基于文献的四层模型，该模型将神经节苷脂/SV2相关的结合、pH依赖性的内吞作用与轻链转移、SNAP-25切割以及再神经化/重塑过程联系起来，并进行了校准。该模型通过数值验证，根据预定义的时间尺度目标进行了评估，并通过逐一分析和Morris全局敏感性分析进行了测试。在基线时，三元复合物的形成达到了有效局部BoNT/A输入的90.09%，胞质轻链在77.0分钟时达到0.07156 nM的峰值。力量下降至最低点发生在第4.2天，剩余力量为26.1%。功能恢复分别在61.6天、96.6天和126.4天时达到50%、75%和90%，而分子SNAP-25切割的50%阈值则出现在329.5天。所有八个一致性目标都得到了满足。Morris筛选显示，功能恢复主要由再神经化参数驱动，而分子持久性则受毒素暴露、切割效率和轻链持久性的影响。将恢复层与啮齿动物的观察结果重新关联后，功能恢复在27.9天时实现；而未改变的分子层则导致了更大的分子与功能时间尺度比；在保持分子不变性的条件下，不同的发芽潜伏期使功能恢复时间推迟了30天。在三次模拟注射中，切割的SNAP-25负担增加到85%，恢复时间延长，这种延长的敏感性主要由毒素暴露和切割效率决定，而不是基线的再神经化参数。这些扩展测试了模型内部的一致性，而非提供外部验证。该框架支持再神经化/重塑是长时间分子阻断与早期功能恢复之间的一种合理解释，并表明在重复给药的情况下，这两者之间的耦合越来越强。

引言
肉毒杆菌神经毒素A型（BoNT/A）是已知最有效的细菌毒素之一（Montecucco和Molgó，2005年），但它已成为神经学、皮肤病学、康复医学、疼痛治疗、自主神经系统疾病和美容医学中广泛使用的治疗剂（Chen，2012年；Dressler和Johnson，2022年）。其临床效果通常归因于在突触前末端切割突触相关蛋白25（SNAP-25）后抑制乙酰胆碱的释放（Blasi等人，1993年；Montal，2010年；Pirazzini等人，2017年；Rossetto等人，2014年；Turton等人，2002年）。这种解释是正确的，但它并不能完全解释毒素活性的分子持续时间与临床恢复时间进程之间的差异。BoNT/A的生物学效应不是由单一步骤控制的。结合突触前受体、内吞作用、轻链的内体转移、细胞内持久性、SNAP-25切割、轴突发芽以及随后的末端重塑都发生在不同的时间尺度上（de Paiva等人，1999年；Foran等人，2003年；Keller，2006年；Pirazzini等人，2017年；Whitemarsh等人，2013年）。在临床实践中，BoNT/A的效果会在三到四个月内减弱，而对人类进行的连续电生理学研究描述了肌肉动作电位的相应下降和部分恢复（Eleopra等人，1998年；Hamjian和Walker，1994年）。直接的生化测量显示了一个更长的时间过程：在暴露后80天内，脊髓培养物中切割的SNAP-25与完整SNAP-25的比例基本保持稳定（Keller等人，1999年）；在大鼠腓肠肌神经末端，即使在肌肉功能已经恢复后，切割的SNAP-25仍可检测到超过两个月（Jurasinski等人，2001年）；对于BoNT/A1、A2、A4和A5，轻链的催化活性至少持续了十个月，而对于A3，则约为五个月（Whitemarsh等人，2014年）。这两类测量描述的是不同时间尺度上的不同量，因此临床恢复不应简单地解释为分子SNAP-25损伤的消失。这一区别是我们模型的出发点。如果肌肉功能的恢复需要完全恢复原始末端的完整SNAP-25，那么临床无力预计会持续与分子损伤相同的时间。相反，功能的相对早期恢复表明在分子损伤仍然存在时，有其他生物过程促进了恢复。再神经化和神经肌肉重塑为这种明显的不匹配提供了合理的解释，因为新形成的或重组的突触接触可以在分子完全恢复之前支持功能恢复（de Paiva等人，1999年；Keller，2006年）。在这项研究中，再神经化指的是毒素诱导的去神经作用后通过轴突发芽及相关末端适应形成功能性的突触接触。重塑指的是神经肌肉接头的后续结构和功能重组，包括在母末端逐渐恢复释放能力。这些过程在体内是紧密相连的。由于没有人类肌肉特异性的发芽和重塑速率常数，我们将它们表示为一个校准的恢复层，而不是直接测量的分子速率常数。因此，我们开发了一个基于文献的混合模型，将BoNT/A的分子持久性与神经肌肉接头的功能恢复联系起来。我们的目的不是估计临床剂量、注射深度、重新治疗间隔、制剂差异或患者特异性反应，而是为了检查在透明的、基于生物学的计算框架内，持续的分子阻断和早期功能恢复是否可以共存，并且在当前版本中，当转移到啮齿动物的恢复时间尺度上，当施加纤维类型差异的发芽潜伏期时，以及当注射重复时，该框架是否表现一致。

模型范围和整体结构
我们开发了一个四层计算模型，以研究长时间BoNT/A分子活性如何与神经肌肉接头的早期功能恢复共存。该模型并非旨在再现特定的临床剂量、制剂、注射部位、肌肉组或个体患者反应。相反，我们使用了一个代表性的局部末端暴露情景来研究分子阻断与力生成能力恢复之间的关系。

模型基线：分子进入和轻链暴露
在代表性的基线情景中，第1层产生了高效的受体相关表面复合物形成。最终的三元BoNT/A–神经节苷脂–SV2复合物达到了有效局部BoNT/A输入的90.09%，表明在选定的受体池条件下，大部分模型中的毒素进入了内化状态。这个值应在代表性的暴露情景中解释，而不是直接估计人类肌肉中的受体占有率。

讨论
在这项研究中，我们开发了一个四层混合模型，以研究BoNT/A分子持久性与神经肌肉接头功能恢复之间的关系。主要发现是分子恢复和功能恢复遵循的时间尺度不同。在代表性的基线情景中，功能力量在61.6天时达到50%的恢复，而分子SNAP-25切割的50%阈值则在329.5天时出现。这种267.9天的分离并未被解释为...

结论
我们的研究表明，BoNT/A长期分子持久性与较短的功能恢复之间的明显不匹配可以通过将分子阻断与神经肌肉输出的恢复分开来解释。当将再神经化和重塑视为不同的恢复层时，持续的SNAP-25切割和力量的恢复并不是互斥的。扩展分析表明，当恢复层重新与啮齿动物的时间尺度关联时，这种分离得以保持...

作者贡献声明
Nur Ecer：写作 - 审查与编辑、撰写原始稿件、验证、监督、资源提供、调查、概念化。
Birol Kaldan：写作 - 审查与编辑、撰写原始稿件、软件开发、资源提供、调查。
Bahad?r Aslancan：写作 - 审查与编辑。
Ay?egül Tel Kank?l??：写作 - 审查与编辑、撰写原始稿件、监督、资源提供、调查。
Omer Karakoyun：写作 - 审查与编辑、撰写原始稿件、验证、软件开发、项目知情同意声明（不适用）。

知情同意
不适用。本研究未涉及任何人类受试者。

机构审查委员会声明
不适用。本研究未使用任何患者级数据，未涉及任何人类受试者，也未进行动物实验。

数据可用性声明
支持这项工作的所有材料都公开存储在Zenodo上，网址为https://doi.org/10.5281/zenodo.21840660，该概念标识符始终指向最新版本（版本1.0，网址为https://doi.org/10.5281/zenodo.21840661），代码遵循MIT许可协议，其他文件遵循CC BY 4.0许可。存档包含了第1层到第4b层的Python实现、参数集和参数来源表、生成的第1层到第4层的输出、一致性评估结果等。

利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。

伦理批准
这项计算建模研究不需要机构审查委员会或伦理委员会的批准，因为它涉及：
- 仅使用来自同行评审文献的已发布的公开数据
- 数学建模和仿真方法
- 未收集新的个人或动物数据
- 未接触患者记录或机密信息

人类受试者
本研究未涉及任何人类受试者。虚拟患者群体中使用的所有解剖参数均来自同行评审文献中的已发布群体水平统计数据。未访问或使用任何个别患者数据。

数据来源
本研究使用的所有数据均来自：
- 已发布的同行评审科学文献
- 公开可用的解剖和生理数据库
- 之前发布的临床试验结果（仅摘要数据）
- 来自文献来源的已建立的药代动力学参数

隐私和保密性
不适用。本研究未访问或使用任何个别患者数据或机密信息。

研究完整性
这项计算研究遵循以下原则：
- 负责任的研究行为原则
- 计算建模研究标准
- 二次数据分析指南
- 可重复研究的最佳实践

数据共享和透明度
- 所有计算代码将公开可用
- 模型参数和假设均有完整记录
- 虚拟患者生成方法有完整描述
- 结果透明呈现，并明确说明限制

机构批准
虽然这项计算研究不需要正式的伦理批准，但研究是在[机构名称]的全面支持和认识下进行的。所有作者所属机构都支持促进医学知识的开放科学研究和计算建模研究。

合规声明
本研究符合：
- 赫尔辛基原则（虽然不直接适用于计算研究，但原则得到遵守）
- 国际负责任研究行为指南
- 机构关于计算研究的政策
- 期刊对伦理研究的政策要求

限制和免责声明
作者承认：
- 该计算模型生成的是假设，而非临床建议
- 所有预测都需要前瞻性的临床验证
- 结果不应在没有适当验证研究的情况下应用于临床实践
- 本研究仅用于学术和科学目的

作者声明
作者承诺负责任地共享计算方法和发现，以支持毒理学研究的进展，同时确保结果在其限制范围内得到适当解释。

作者声明
所有作者保证，这项研究是按照计算研究的适用指南进行的，并且符合伦理要求。