肝细胞癌中RB1双等位基因缺失作为人工智能指导治疗的合成致死靶点

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Biallelic loss of RB1 in hepatocellular carcinoma as synthetic lethal target for artificial intelligence-guided therapy

　　

视黄母细胞瘤（RB1）基因是一个关键的肿瘤抑制基因，调控细胞周期进展和基因组稳定性。尽管RB1改变在肝细胞癌（HCC）中已有报道，但RB1双等位基因失活（RB1-Bi）的生物学和临床后果仍不清楚。研究人员对来自TCGA-LIHC（n=355）和内部AMC（n=206）队列的HCC患者进行了全面的等位基因特异性基因组分析，共同组成了AMC-TCGA发现队列。在这个合并队列中，RB1-Bi在14.6%的肿瘤中被发现，富集于低分化HCC，并且与显著降低的总生存期独立相关（调整后风险比3.32，95% CI 1.93–5.72，p?肝细胞癌（HCC）是全球第四大癌症相关死亡原因，尽管系统治疗取得进展，但多数患者最终产生耐药，且缺乏指导个体化治疗的预测性生物标志物。RB1基因是调控细胞周期G1/S检查点的关键抑癌基因，其双等位基因失活（RB1-Bi）在HCC中的真实患病率、生物学后果及治疗靶点尚未明确。为此，研究人员开展本研究，旨在通过等位基因特异性分析定义RB1-Bi的基因组图谱、临床意义，开发基于人工智能（AI）的病理学识别模型，并通过系统药物筛选发现合成致死（synthetic lethal）靶点。该研究发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

主要关键技术方法包括：利用AMC-TCGA发现队列（n=561，包含206例AMC中心和355例TCGA-LIHC患者）及多个独立验证队列（如GSE164121、AMC-ICI、MSKCC、Ajou等），进行全外显子测序（WES）、RNA测序、SNP阵列分析；采用空间转录组学（10x Visium）和单细胞RNA测序（GSE156625）探究肿瘤微环境；基于深度学习构建特征重校准-多实例学习（FR-MIL）模型，从H&E染色全切片图像（WSI）预测RB1-Bi状态；通过CRISPR/Cas9在Huh7、PLC/PRF/5、HepG2细胞中建立RB1敲除（RB1^?/?）等基因模型，并利用三组小分子化合物库（表观遗传学库128种、激酶抑制剂库430种、高选择性抑制剂库318种）进行高通量药物筛选；体内验证采用PLC/PRF/5异种移植裸鼠模型。

**结果部分：**

**Characterization of HCC with biallelic inactivation of RB1 (RB1-Bi)**：通过整合拷贝数变异和致病突变，将患者分为RB1野生型（RB1-WT）、单等位基因失活（RB1-Mono）和双等位基因失活（RB1-Bi）。RB1-Bi定义为纯合缺失、双等位致病突变或单拷贝缺失伴杂合性丢失（MutLOH）。在AMC-TCGA发现队列中，RB1-Bi占14.6%，且RB1-Bi肿瘤中RB1表达显著降低，致病突变富集于N端和口袋A结构域。

**Prevalence and prognostic significance of RB1-Bi in discovery and validation cohorts**：在发现队列中，RB1-Bi与更差的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）独立相关（调整后风险比分别为3.32和3.15）。验证队列（GSE164121）中同样观察到OS显著下降，但在免疫治疗或索拉非尼治疗队列中未发现生存差异。

**Clinical and genomic characteristics of RB1-Bi tumors**：RB1-Bi肿瘤更多为低分化，与TP53突变共现，与CTNNB1突变互斥。功能上，RB1-Bi肿瘤富集细胞周期通路（E2F靶标、G2M检查点等）和DNA修复通路，且拷贝数变异频率更高。免疫微环境分析显示CD8⁺、CD4⁺T细胞、NK细胞浸润减少，免疫检查点分子表达降低，RB1-Bi肿瘤富集于免疫沙漠亚型。

**Clonal status and chromosomal duplications in RB1-Bi HCCs**：RB1-Bi事件多为早期克隆事件，且与全基因组加倍（WGD）显著相关，独立于TP53突变。多区域测序分析表明RB1-Bi在肿瘤进化中早期出现。

**Deep learning-based classification of RB1-Bi in HCC**：FR-MIL模型在TCGA-LIHC内部验证集F1得分为79.7%，在独立AMC队列中达84.4–91.6%，在Ajou队列中为82.8%，且预测性能不受组织学分级影响。

**Screening for “synthetic lethal” drugs in RB1-deficient HCC models**：药物筛选发现AURKA、KSP、PLK1和PARP抑制剂在RB1^?/?细胞中具有合成致死效应。通过siRNA敲低和RB1回补实验证实靶点依赖性。

**Mitotic dysregulation and impaired canonical DNA repair in RB1 deficiency**：RB1缺失导致有丝分裂延迟、有丝分裂指数升高、E2F驱动转录失调。DNA双链断裂修复报告实验显示RB1^?/?细胞中非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）活性均降低，且不依赖BRCA1/2。

**Pharmacologic targeting of mitotic and DNA repair vulnerabilities in RB1-deficient HCC**：四种抑制剂均诱导RB1^?/?细胞G2/M阻滞，AURKA、KSP、PLK1抑制剂引起纺锤体异常，PLK1和PARP抑制剂增加γ-H2AX水平。联合治疗（AURKA抑制剂+PARP抑制剂或KSP抑制剂+PARP抑制剂）表现出强协同效应。

**In vivo validation of RB1 synthetic lethal targets**：在PLC/PRF/5异种移植模型中，四种单药均显著抑制RB1^?/?肿瘤生长，且联合治疗疗效优于单药，未出现明显肝毒性。

**讨论与结论**：本研究证实RB1-Bi是HCC中一个生物学和临床独特的亚型，与不良预后、有丝分裂失调、DNA修复缺陷及免疫抑制微环境相关。通过AI病理模型可准确识别RB1-Bi患者，并发现两类合成致死药物（有丝分裂调节剂抑制剂和DNA损伤反应通路抑制剂），为精准医学提供了 biomarker-driven 治疗策略。结论指出，RB1-Bi定义了一类侵袭性HCC亚型，对两类抑制剂敏感，结合数字病理AI技术，未来应开展针对该亚型的临床试验。

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