《Scientific Reports》：Comparative analysis of surface coatings for human neural co-cultures identifies fibronectin as a robust MEA substrate
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人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元为基于动物的神经毒性模型提供了一种有前景、生理学相关的替代方案。然而，表面涂层这一基本但重要变量的影响常常被忽视。在此，研究人员系统研究了常用表面涂层，包括聚合物（聚乙烯亚胺（PEI）、聚-L-鸟氨酸（PLO）、聚-
人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元为基于动物的神经毒性模型提供了一种有前景、生理学相关的替代方案。然而，表面涂层这一基本但重要变量的影响常常被忽视。在此，研究人员系统研究了常用表面涂层，包括聚合物（聚乙烯亚胺（PEI）、聚-L-鸟氨酸（PLO）、聚-D-赖氨酸（PDL）、聚-L-赖氨酸（PLL））以及细胞外基质（ECM）蛋白（层粘连蛋白（LN）、纤连蛋白（FN）、Matrigel）对NGN2神经元、原代人星形胶质细胞以及神经元/星形胶质细胞共培养的影响。在仅聚合物涂层上培养的神经元表现出较不成熟的神经元网络。有趣的是，在添加LN的聚合物、仅LN、FN和Matrigel上的神经元在蛋白质和基因表达上没有差异，但在与原代人星形胶质细胞共培养中显示出不同的电生理特征。网络爆发数量的峰值在不同时间点达到，其中FN和Matrigel早在第2周就达到峰值。尽管FN在微电极阵列（MEA）中很少使用，但在其上的共培养显示出稳定的细胞-电极耦合和稳健的活动模式，直至第6周。在一项原理验证实验中，研究人员在供体匹配的hiPSC来源共培养系统中进一步评估了LN、FN和Matrigel，支持了观察到的效应。本研究强调了涂层选择对于建立神经培养的重要性，最终提高了用于药物开发的hiPSC来源神经元模型的成熟度和稳健性。
**研究背景与问题**
在神经科学药物发现领域，大量针对中枢神经系统的候选药物因疗效不足或意外毒性在临床试验中失败，原因之一是临床前模型预测能力有限，常依赖啮齿动物系统或永生化细胞系，无法准确模拟人类生理。人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元为体外建模提供了新工具，但需稳健的检测系统以验证功能。微电极阵列（MEA）技术可无标记长期监测神经元电生理，但表面涂层这一基础变量常被忽视。常用涂层包括合成聚合物（如聚乙烯亚胺（PEI）、聚-L-鸟氨酸（PLO）、聚-D-赖氨酸（PDL）、聚-L-赖氨酸（PLL））及细胞外基质（ECM）蛋白（如层粘连蛋白（LN）、纤连蛋白（FN）、Matrigel）。先前研究虽涉及涂层比较，但多聚焦于形态学，缺乏对电生理功能的系统评估。此外，星形胶质细胞在共培养中至关重要，其响应不同涂层的差异也未被充分关注。因此，研究人员开展本研究，旨在系统比较多种涂层对hiPSC来源NGN2神经元、人原代星形胶质细胞及其共培养的影响，以确定促进稳健网络成熟和可重复电生理活动的涂层策略。
**研究内容与意义**
研究人员使用NGN2诱导的hiPSC来源兴奋性神经元（BIONi010-C-13系），结合人原代星形胶质细胞（ScienCell #1800）及供体匹配的hiPSC来源星形胶质细胞（BIONi010-C系），在7种涂层（PEI、PLO、PDL、PLL、LN、FN、Matrigel）及聚合物-LN组合上培养，通过形态学、活力、增殖、基因表达及MEA电生理记录，系统评估涂层对神经元-星形胶质细胞共培养的影响。论文发表在《Scientific Reports》。研究结论：FN作为少用涂层，在MEA上表现出最稳健的电活动，支持长期稳定和低变异性，强调涂层选择是影响功能结果的关键参数，对药物筛选平台标准化具有重要意义。
**关键技术方法**
主要方法包括：使用NGN2诱导的hiPSC来源神经元（BIONi010-C-13系）及人原代星形胶质细胞（ScienCell #1800）和hiPSC来源星形胶质细胞（BIONi010-C系）；通过MEA（Maestro Pro系统，Axion Biosystems）每周记录5分钟自发活动，分析平均发放率（MFR）、爆发数、网络爆发数、同步指数等参数；免疫细胞化学（ICC）染色（TUBB3、Ki67、MAP2、GFAP、Tau）结合图像分析；荧光素二乙酸酯/碘化丙啶（FDA/PI）活死染色；RT-qPCR检测基因表达（GFAP、NES）。所有实验使用三批独立神经元分化批次作为生物学重复。
**研究结果**
**hiPSC来源神经元表现出依赖于涂层的形态和增殖**
通过明场图像和神经突/胞体面积比分析，仅聚合物涂层（PEI、PLO、PDL、PLL）上的神经元神经突网络较不成熟，而聚合物-LN组合、LN、FN和Matrigel上的神经元在第14天神经突面积显著更高。FDA/PI染色显示，仅聚合物涂层上神经元活力随时间下降（低于60%），而FN上活力从第1天53.2%升至第14天约85%。Ki67免疫染色表明，仅聚合物涂层上Ki67阳性细胞比例高达80-90%，提示增殖活跃、分化不成熟；而含ECM涂层上比例低于15%，表明更成熟。
**星形胶质细胞在LN、FN和Matrigel上具有更高融合度和活力**
在LN、FN和Matrigel上，星形胶质细胞呈铺展扁平形态，融合度达70-90%；在仅聚合物涂层上，细胞呈星形、孤立且融合度低（10-50%）。FDA/PI染色显示，仅聚合物涂层上星形胶质细胞活力显著下降（第14天约20%），而ECM涂层上活力高。RT-qPCR显示，仅聚合物涂层上星形胶质细胞GFAP和Nestin（NES）表达升高，提示反应性表型。基于此，研究人员排除了仅聚合物涂层用于后续分析。
**MEA记录显示共培养活动模式依赖于涂层**
在NGN2神经元与原代人星形胶质细胞共培养中，MEA分析显示：所有涂层在第3周活性电极比例最高（96.9-100%），但FN维持100%至第6周，而其他涂层降至71-85%。平均发放率（MFR）在第3周FN最高（25.9 Hz），显著高于PLO-LN等。网络爆发数峰值时间不同：FN和Matrigel在第2周达到峰值，而聚合物-LN组合在第3周，LN在第4周。FN的网络爆发数从峰值到第6周下降仅30%，而其他涂层下降约80%。同步指数从第3周起均较高，但FN在第5周达0.95且保持稳定。主成分分析（PCA）在第3周和第6周均显示ECM蛋白涂层（LN、FN、Matrigel）与聚合物组合涂层形成两个不同簇，FN位于高活跃和高同步区域。
**涂层间共培养网络活动变异性的时间变化**
通过计算变异系数（CoV）评估孔间和批次间变异性。在第3周，FN和Matrigel的爆发数CoV较低；第6周，仅FN的爆发数CoV低于30%，其他涂层高达40-95%。网络爆发数和同步指数的CoV在FN和LN上随培养时间下降，标准偏差减小，表明长期培养中ECM纯涂层增强了功能读出的稳健性。
**供体匹配hiPSC共培养中涂层依赖效应的验证**
在供体匹配的hiPSC来源神经元-星形胶质细胞共培养中，MEA分析显示：FN和Matrigel支持更快的活性电极增加，第6周时Matrigel达100%，FN达87.3%，LN仅66.4%。PCA显示LN与FN、Matrigel分离，LN网络同步性较低。MFR和爆发数在Matrigel上显著高于LN，网络爆发数在FN和Matrigel上约为LN的5倍，但FN与Matrigel之间无显著差异。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究证实表面涂层选择关键影响hiPSC来源NGN2神经元共培养的功能网络发育，支持并扩展了先前工作。仅聚合物涂层导致神经元活力低、增殖高、星形胶质细胞反应性表型，而ECM蛋白涂层（尤其是FN）促进神经元存活、成熟和稳健电活动。FN通过整合素信号通路（如α5β1整合素-粘着斑激酶（FAK）轴）可能介导存活效应。MEA分析显示，FN在6周内维持100%活性电极、高同步性和低变异性，且网络爆发峰值较早，适合早期检测窗口。PCA区分了ECM蛋白涂层与聚合物组合涂层，强调ECM蛋白涂层整体功能模式相似但存在参数差异。供体匹配共培养验证了FN和Matrigel的优越性，但FN作为单一人源ECM蛋白（而非鼠源LN或Matrigel）可能提高可重复性。研究局限性包括：仅限于NGN2诱导的皮质神经元，特定培养条件，未测试其他涂层（如脑脱细胞基质），且FN在健康成年脑中主要存在于血管基底膜，其生理相关性需进一步研究。
**研究结论**
总之，本研究强调，涂层是神经元和神经元-星形胶质细胞共培养检测中一个关键但常被忽视的参数。值得注意的是，FN（纤连蛋白）是一种很少选用的涂层，它在hiPSC来源的NGN2神经元中支持了稳健的电活动，表明不太常见的涂层可能最适合特定应用。此外，FN可作为人源性替代Matrigel。使用单一ECM蛋白而非复杂的ECM蛋白混合物可提高体外模型的可重复性和标准化。因此，涂层选择应被视为主要实验参数，特别是对于药物筛选平台，因为它可以显著改变细胞反应，从而影响检测结果的可靠性。因此，优化涂层不仅是技术需求，也是将体外筛选结果转化为临床相关预测的必要条件。
