肌萎缩侧索硬化症新型联合疗法的绿色定量分析方法：基于EPPI框架的评估

《Scientific Reports》：Green analytical methods for quantification of a new combination therapy for amyotrophic lateral sclerosis: assessment by EPPI framework

　　

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种进行性神经退行性疾病，其特征是上、下运动神经元的退化，导致进行性肌肉无力、瘫痪和呼吸衰竭。最近提出的由塞来昔布(Celecoxib, CLX)和盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride, CPR)组成的联合疗法已成为治疗ALS和其他神经退行性疾病的潜在方案。本研究旨在开发并验证简单、灵敏、环保且具有成本效益的分析方法，用于同时测定散装粉末、实验室制备的药片和血浆中的CLX和CPR。研究人员建立了两种紫外分光光度法。第一种方法依赖于在318 nm处直接测量CPR的吸光度，以及在266 nm的等吸收点(Isosbestic point)测量CLX的吸光度；第二种方法采用一阶导数比率光谱法(First-derivative ratio spectrophotometry)，分别在280 nm和254 nm处选择性测定CPR和CLX。此外，研究人员还开发了一种反相高效液相色谱法(Reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)，使用C₁₈固定相、优化的流动相组成，并结合二极管阵列检测器(DAD)和荧光检测器(FLD)，实现了两种分析物的高效分离和准确定量。在优化样品制备方案以最大限度地减少基质干扰并提高分析物回收率后，所开发的程序成功应用于实验室制备的药片和血浆。验证结果显示，在所研究的浓度范围内具有极好的线性，以及令人满意的准确度、精密度、选择性和灵敏度，证实了所提出方法在常规质量控制和生物分析应用中的可靠性。使用环境性能与实用性指数框架进一步评估了所开发方法的整体分析性能和环境可持续性，证明了它们作为测定CLX和CPR的可靠且可持续的分析方法的适用性。

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种灾难性的神经退行性疾病，主要导致运动神经元退化，引发肌肉无力和瘫痪，严重威胁人类健康。目前，由塞来昔布(Celecoxib, CLX)和盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride, CPR)组成的名为Prime C的联合疗法被认为具有协同增效、降低剂量及延缓耐药性的优势，成为治疗ALS的潜在候选方案。然而，文献中缺乏同时测定该两种药物的光谱或色谱方法，仅有一篇同步荧光分析法的报道。因此，亟需开发灵敏、经济且高效的新型分析方法以支持该联合疗法的质量控制与生物分析。在此背景下，研究人员成功开发了同时测定CLX和CPR的分析方法，并验证了其可靠性，研究成果发表在《Scientific Reports》上。该研究不仅填补了该药物组合分析方法的空白，还通过结合分光光度法与色谱法，为药物监测和质量控制提供了一种兼顾高分析性能与环境可持续性的前瞻性分析策略，具有重要的临床监测与制药应用意义。

为开展此项研究，研究人员主要采用了三大关键技术方法。首先是基于等吸收点(Isosbestic point)与一阶导数比率光谱法(First-derivative ratio spectrophotometry, FDR)的紫外分光光度法；其次是结合二极管阵列检测器(DAD)与荧光检测器(FLD)的反相高效液相色谱法(Reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)；最后，研究引入了环境性能与实用性指数框架对方法进行综合绿色评估。在生物样本来源方面，研究使用了雄性Sprague-Dawley大鼠的血浆样本（经亚历山大大学机构动物护理与使用委员会批准）进行 spiked plasma 样本分析。

研究结果部分概述如下：

Spectrophotometric methods（分光光度法）：通过扫描两种药物的零阶吸收光谱，研究人员发现由于光谱重叠，无法直接测定CLX。通过研究确立在318 nm处直接测定CPR，在266 nm的等吸收点处测定混合物总浓度，通过相减得出CLX浓度。此方法成功解决了光谱重叠问题。

Optimization of first derivative ratio method (FDR)（一阶导数比率法的优化）：为消除背景干扰并解决重叠问题，研究人员对FDR方法的两个关键参数进行了优化。通过测试不同的波长增量(?λ)和除数浓度，最终确定?λ为5 nm、使用3 μg/mL CPR作为除数测定CLX（254 nm），以及12 μg/mL CLX作为除数测定CPR（280 nm）为最佳条件，实现了无需分离即可准确分析二元混合物。

RP-HPLC method（反相高效液相色谱法）：通过考察不同缓冲液和有机改性剂比例，研究人员确定85%乙腈:15%水为最优流动相，使CPR与CLX的保留时间分别为2.08 min和3.77 min。在检测器选择上，DAD确保了测定的高选择性，而FLD则提供了高灵敏度。此方法在复杂基质中表现出优异的分离效率和重现性。

Validation of the proposed methods（所提方法的验证）：依据国际协调会议(ICH)指南，研究人员对方法的线性、精密度、准确度等进行了全面验证。结果显示，各方法的相关系数均≥0.999。同时，依据FDA指南进行了大鼠血浆中定量下限(LLOQ)测定及稳定性研究，证实所有方法的相对误差和相对标准偏差均符合生物样本分析要求。

Greenness assessment（绿色度评估）：为评估分析方法的可持续性，研究应用了EPPI框架。评估表明，分光光度法因无需过滤且能耗低，被视为理想绿色方法；而RP-HPLC虽在PPI评分上略逊于荧光法，但因其使用更少的重组溶剂，在生物流体分析中的环境指数(EI)优于已报道方法。所有提出方法的EPPI总分均大于75，被证实为兼具高效性与环保性的绿色分析手段。

在讨论部分，研究人员强调，结合分光光度法与RP-HPLC技术为在制剂及生物样本中同时测定CLX和CPR提供了一种强大且灵活的分析策略。分光光度法快速、经济，适合高样本通量的常规质量控制；而RP-HPLC以其卓越的灵敏度和选择性，完美适用于血浆等复杂基质的分析。两种方法的优势互补满足了多样化的分析需求。结论表明，本研究开发的分光光度法提供了一种快速且环保的途径，而RP-HPLC法则确保了复杂基质下的高效分离与准确定量。通过EPPI模型的评估确认，这些方法在保证高水平分析性能的同时，兼顾了环境可持续性，代表了支持可靠药物监测、高效质量控制及绿色药物分析的前沿分析工具。