综述：肝和胃肠人组织中微塑料检测的分析方法：综述与方法学框架

《Microplastics》：Analytical Methods for Microplastic Detection in Hepatic and Gastrointestinal Human Tissues: A Review and Methodological Framework

　　

微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）在人类肝和胃肠（GI）组织中积累。然而，采样策略、组织制备、分析技术和质量保证程序的差异导致方法学上显著的异质性，限制了已发表结果的可比性和可重复性。因此，本综述旨在批判性评估当前用于检测和表征肝和GI组织中MPs和NPs的分析方法学，突出方法学优势、局限性和新兴技术，并确定方法学标准化的优先事项。研究表明，没有任何单一分析技术能同时提供关于颗粒尺寸、形态、聚合物组成、空间定位和浓度的全面信息。尽管拉曼光谱、傅里叶变换红外（FTIR）光谱、热解气相色谱-质谱联用（Py-GC/MS）和新兴多模态成像技术各自提供独特优势，反映了其不同的基本检测原理，方法学变异性仍然是跨研究比较的主要障碍。人体组织研究进一步受到样本可用性有限、污染风险和不一致的质量保证程序的限制。未来的进展将依赖于协调统一的、特定器官的分析流程，整合优化的组织消化、严格的污染控制、互补的光谱方法和标准化的报告指标。建立统一的方法学指南对于提高可重复性、促进定量证据综合，以及推进肝和胃肠组织中MPs和NPs的环境暴露评估和临床研究至关重要。

论文主体部分总结如下：

**1. 引言**
微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）污染已成为全球环境和公共卫生关注点。人体通过受污染食物、饮用水、空气颗粒物和塑料食品包装等多途径暴露于MPs/NPs。一旦被内化，MPs/NPs可转运并积累于多个器官，包括胃肠道（GI）、肝脏、肾脏、肺和心脏，并与氧化应激、慢性炎症、线粒体功能障碍、代谢紊乱和细胞稳态受损相关。尽管认识不断提高，但在人体生物组织中准确检测这些颗粒仍面临技术挑战，包括极低浓度、异质性、小尺寸和生物基质复杂性。缺乏标准化采样、消化、污染控制和验证分析流程导致已发表研究间存在显著变异，限制了可比性和可重复性。本综述旨在全面概述当前用于人类肝和GI组织中MPs和NPs检测与表征的分析方法学，批判性评估现有技术的优缺点，讨论主要方法学挑战，并确定方法学标准化的优先事项。

**2. 微塑料在人消化系统中的摄取**
GI道是人体MPs暴露的主要途径，主要通过摄入受污染食物和饮料。MPs与肠上皮相互作用，其摄取和系统分布取决于颗粒的理化性质，包括尺寸、形状、表面电荷和表面化学。已提出多种机制促进MPs穿过肠屏障的吸收，包括肠上皮细胞的内吞作用、Peyer's斑内M细胞介导的转胞吞作用、通过紧密连接破坏的细胞旁转运，以及纳米尺度颗粒的被动扩散。一旦被内化，MPs可进入淋巴循环或门静脉系统，通过肠-肝轴转运至肝外器官，特别是肝脏。在GI道中，积累的MPs与肠道菌群组成改变、黏液层破坏、上皮屏障完整性和肠道通透性增加相关。通过肠-肝轴，肠屏障功能障碍可能放大肝脏对MPs及其相关污染物的暴露。肝脏被认为是MPs积累的主要器官，因为它直接接收来自肠道的门静脉血液。在肝组织中，MPs可被库普弗细胞和肝细胞内化，触发氧化应激、线粒体功能障碍、炎症信号和代谢紊乱。实验证据进一步表明，MPs可干扰肝脏脂质代谢、通过焦亡和铁死亡途径促进肝细胞死亡，并损害消化酶活性。

**3. 样本采集与前分析考虑**
MPs分析在人体组织中的可靠性从根本上取决于标准化样本采集和严格的污染控制。大于1微米的颗粒已知可穿过胃肠黏膜，化学组成理论上可仅用显微光谱学确认。人体GI和肝样本通常来自手术切除、诊断活检或尸检标本。组织应使用金属或玻璃工具处理，避免塑料耗材。样本质量、解剖位置、采集时间和患者元数据应记录，因为这些变量影响定量比较。新鲜组织应在采集后立即在-80°C下冷冻。冷冻保存可最小化酶降解并保持组织形态而不改变聚合物组成，是拉曼光谱、显微FTIR（μ-FTIR）和热解气相色谱-质谱联用（Py-GC/MS）等光谱分析的首选方法。存档病理组织样本代表有价值资源，可在其天然组织环境中检测外源性颗粒如MPs。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本在病理档案中广泛可用，是回顾性研究的有吸引力的资源，但固定、脱水、石蜡包埋和溶剂基脱蜡可能引入污染或影响非常小颗粒的回收。

**4. 组织消化方法**
高效组织消化是MPs分析中的关键前分析步骤，因为它去除生物基质同时保持塑料颗粒的理化完整性。理想的消化方案应实现蛋白质、脂质和其他有机成分的完全降解而不改变聚合物形态、质量或化学组成。消化方法的选择取决于组织类型、分析技术、目标聚合物和所需颗粒尺寸范围。人类GI和肝组织由于高蛋白和脂质含量呈现特殊挑战，通常需要优化或组合消化策略。

**4.1. 化学消化**
化学消化是MPs从生物组织中提取最广泛使用的方法，因其低成本、操作简单和适合处理大量样本。氢氧化钾（KOH）通常以10-30%浓度应用，有效消化蛋白质同时保存大多数常见聚合物，包括聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚苯乙烯（PS），回收率通常为85-100%。过氧化氢（H₂O₂）是一种氧化试剂，在控制条件下一般保持聚合物完整性，回收率通常与KOH相当或略高，适用于中等有机含量组织。硝酸（HNO₃）提供快速高效消化，但对聚酰胺（PA）、聚氨酯（PU）、聚甲醛（POM）和偶尔PET有降解作用，不推荐用于全面聚合物鉴定。次氯酸钠（NaOCl）是另一种氧化剂，可氧化和变色多种聚合物，降低小颗粒回收率，限制其适用性。

**4.2. 酶消化**
酶消化选择性降解生物大分子同时最小化对MPs的损伤，通常提供更优的聚合物保存。蛋白酶K水解蛋白质，报告回收率约为93-95%对PA、PET和PVC，约76%对高密度PE，消化效率超过97%。脂肪酶水解甘油三酯，改善脂肪组织如肝脏的消化，常与蛋白酶K联合使用，回收率约87%，消化效率97-98%。对于脂质密集组织如肝脏，脂肪酶与蛋白酶K的组合通常被认为是最合适的消化策略。胰蛋白酶消化蛋白质，提供温和条件，但消化效率低于蛋白酶K，处理时间较长。

**4.3. 组合消化策略**
没有单一消化方案适用于所有组织类型或聚合物类别。对于GI组织，组合消化策略可能更有用，通常将酶消化与温和化学氧化或碱处理配对以最大化有机质去除同时保持聚合物完整性。几种组合方法已被提出，如蛋白酶K与脂肪酶适用于肝组织，蛋白酶K与纤维素酶适用于肠组织。组合方案通常达到更高消化效率（>95%），聚合物回收率常超过90-98%，改善小于20微米颗粒的回收，但更劳动密集和昂贵。

**5. 分离与颗粒分离**
消化后，MPs必须从残留基质中有效分离并隔离以供后续鉴定和定量。密度分离结合膜过滤是目前最广泛使用的工作流程。密度分离利用MPs与残留无机或有机材料之间的密度差异。常用浮选介质包括饱和氯化钠（NaCl；密度≈1.2 g cm^-3）、氯化锌（ZnCl₂；1.6-1.8 g cm^-3）、碘化钠（NaI；1.6-1.8 g cm^-3）和聚钨酸钠（>1.8 g cm^-3）。真空过滤是消化和密度分离后隔离MPs的标准方法。选择适当过滤膜对回收效率、光谱性能和检测限有显著影响。对于人体组织分析，氧化铝和硅膜通常更受青睐，提供优异光学性能和在拉曼和FTIR分析中最小光谱干扰。硅膜使用光刻微结构硅膜，允许直接光谱分析而不转移颗粒。金属涂层策略如金或铝溅射聚碳酸酯可降低聚合物背景，改善拉曼对比。对于亚微米和纳米颗粒检测，贵金属涂层表面增强拉曼散射（SERS）基底代表一种新兴选项。

**6. 用于微塑料鉴定的分析技术**
MPs由多种聚合物材料组成，需要一系列互补分析方法进行可靠检测和表征。物理和化学性质通常使用显微镜、FTIR和拉曼光谱评估，而液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和热分析技术支持MPs质量浓度定量。FTIR检测偶极矩变化的分子振动，对极性官能团敏感；拉曼光谱检测极化率变化的振动，对非极性和对称结构特征敏感。两种技术是机制上正交的，联合使用减少假阴性和假阳性识别率。形态和表面表征通常使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM），表面官能团和化学组成通过FTIR、X射线光电子能谱（XPS）和紫外-可见光谱（UV-Vis）检查。色谱技术如高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）用于定量添加剂和降解副产物。限制包括：SEM和TEM需要广泛样品制备；FTIR和UV-Vis受复杂生物基质干扰；高精度技术如Py-GC/MS昂贵且需专门知识。纳米塑料检测困难源于衍射极限，但质量基技术如Py-GC/MS和热提取-解吸GC-MS（TED-GC-MS）绕过光学分辨率极限，信号增强策略如SERS、光学光热红外（O-PTIR）光谱和原子力显微镜红外光谱（AFM-IR）可克服这一限制。尼罗红荧光显微镜提供快速低成本筛查，但可能产生假阳性。新兴技术包括激光直接红外（LDIR）成像、AFM-IR、纳米FTIR、高光谱成像、TED-GC-MS、质谱成像和AI辅助图像分析。

**7. 当前证据与方法学差距在人类肝和胃肠组织**
GI道被认为是人类MPs和NPs暴露的主要途径，值得紧急调查。人体研究已在肝硬化患者肝组织中检测到MPs和NPs，提供系统转运和积累的直接证据。然而，伦理限制、种间生理差异和宿主-微生物组相互作用复杂性需要开发替代方法。

**7.1. 来自人类肝组织的证据**
有限但令人信服的证据显示MPs在肝组织中积累。一项研究分析了肝移植受者肝硬化肝组织，采用顺序碱性和氧化消化结合丙酮脱脂，经尼罗红染色和显微拉曼光谱确认，检测到6种聚合物类型（4-30微米）仅存在于肝硬化组织中。该研究优势在于全面质量保证策略，包括空白对照、预过滤试剂和受控实验室条件。另一项多器官尸检研究采用互补分析平台，包括光学显微镜、SEM-EDS、动态光散射、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和O-PTIR，检测到PET、PS、PAN和纤维素衍生物，以及小于20纳米的NPs。这些研究提供汇聚证据，但方法学异质性阻碍定量比较。

**7.2. 来自人类胃肠组织的证据**
直接证据有限，因为组织获取有创且易受污染。一项研究检查了101名个体回肠活检标本，使用偏振光显微镜（PLM）作为筛查，结合Py-GC/MS，发现大多数双折射颗粒为程序性伪影，仅少数真实观察，包括淀粉颗粒和单一粘胶纤维。该研究优势在于严格污染控制框架。另一项研究集中于方法学优化，验证了非侵略性化学和酶消化方案用于人类粪便和猪空肠组织，获得满意回收和重复性，鉴定出PE、PP、PS、PET和合成纤维素。未来研究应整合这两种方法的优势。

**7.3. 肝/GI分析特有的关键方法学张力**
增加分析通量以实现空间分辨率和组织学背景为代价。Py-GC/MS提供高灵敏度总塑料负荷定量但不提供空间信息。FTIR和拉曼显微镜提供尺寸信息和空间映射，允许将颗粒定位到特定解剖或组织学特征。对于肝组织，了解颗粒是否定位到门脉区、肝窦或纤维化区域对建立因果联系至关重要。新兴技术如O-PTIR提供亚微米空间分辨率和无标记化学鉴定，同时保存组织结构。

**7.4. 脂质丰富基质干扰：肝脏特异性分析挑战**
肝脏因其脂质丰富组成呈现独特分析挑战。不彻底脂质去除在消化阶段影响后续鉴定，特别是使用荧光筛查方法时。尼罗红作为亲脂性染料，也结合残留脂质，增加假阳性风险。一项研究显示KOH基消化方案补充沸水冲洗和丙酮脱脂显著改善有机质去除，同时保持高MP回收（97-100%）。未来研究应评估脂质去除效率作为明确分析性能参数。

**7.5. 临床和手术环境中的污染控制**
污染控制是数据质量的关键决定因素，因为临床组织采集引入独特外源塑料污染源。当前证据显示污染控制实践存在显著异质性。只有少数人体组织研究实施了全面程序空白或等效无塑料协议。严格污染控制措施，包括程序空白、受控实验室条件和光谱确认，显著提高分析置信度，但常以较低报告颗粒计数为代价。

**7.6. 超越组织检测的机制性和预测性方法**
近期研究转向理解颗粒暴露的生物学后果并开发预测工具。功能成像方法如DDAO-CT探针可实时无创成像MP诱导肝损伤的胰凝乳蛋白酶活性。计算毒理基因组学分析预测了聚合物肝毒性潜力。人胚胎干细胞衍生肝类器官模型结合体内验证表明，聚丙烯破坏同型半胱氨酸/半胱氨酸代谢。整合人肠细胞模型、慢性小鼠暴露实验和毒代动力学-毒效动力学（TK-TD）建模得出初步人类肠毒性阈值。这些方法应被视为补充而非替代组织检测。

**8. 研究差距与未来方向**
标准化是最高优先，当前研究在消化协议、污染控制、分析平台、检测限和报告方面差异大，阻碍直接比较。分析灵敏度需改进，现有方法偏向微米级颗粒，NPs可能具有更大生物迁移性和毒性。临床证据有限，人体组织研究受限于小样本量、有创采样和方法学异质性。组织检测必须与机制和临床研究整合，结合定量组织分析、多组学、成像、生物标志物和毒理学模型，建立暴露-反应关系。

**9. 结论**
在肝和GI组织中MPs和NPs的检测与表征方面取得了实质性进展，但该领域仍存在方法学异质性。没有单一分析技术能全面表征颗粒尺寸、形态、聚合物组成、空间分布和浓度。互补分析工作流程整合优化组织消化、严格污染控制和多种光谱或成像技术代表最稳健策略。未来进展依赖于标准化、器官特异性方法和协调报告框架，以改进数据可比性，加强机制和流行病学研究，并为基于证据的人类健康风险评估提供基础。