桦褐孔菌（Inonotus obliquus）不育菌核黑色外层粗多糖的提取与纯化优化及其纯化多糖的体外抗氧化活性、肿瘤细胞活力抑制作用和免疫调节活性评价

《Foods》：Optimization of Crude Polysaccharide Extraction and Purification from the Black Outer Layer of the Inonotus obliquus Sterile Conk and Evaluation of the Purified Polysaccharide’s In Vitro Antioxidant Activity, Inhibitory Effects on Tumor Cell Viability, and Immunomodulatory Activity

　　

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）是一种富含多糖、多酚和三萜类化合物的药用真菌。然而，针对桦褐孔菌不育菌核黑色外层中纯化多糖的研究仍十分有限。本研究采用热水提取法提取粗多糖，利用响应面法（response surface methodology, RSM）进行优化，并进一步通过DEAE-52离子交换色谱和Sephacryl S-400 HR凝胶过滤色谱进行纯化。研究人员对纯化多糖（IOP）的结构特征和体外生物活性进行了研究。在优化条件下，粗多糖提取率可达24.64 ± 0.48%。IOP含有88.97 ± 1.33%的总糖和10.91 ± 0.37%的糖醛酸，重均分子量为78.0 kDa。单糖分析表明，IOP由葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析揭示了多糖的特征官能团。IOP表现出浓度依赖性的抗氧化活性，抑制A549、SW1990、4T1和B16F10细胞的活力，对L929成纤维细胞显示出低细胞毒性，并刺激RAW264.7巨噬细胞产生一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）。这些发现初步证明，从桦褐孔菌不育菌核黑色外层中获得的纯化IOP组分在实验条件下表现出体外抗氧化、抑制肿瘤细胞活力和免疫调节活性。

论文解读

真菌多糖是由单糖通过糖苷键连接而成的生物大分子，广泛分布于植物、动物和微生物中，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、调节肠道菌群等多种生物活性，在功能食品、保健品和天然药物领域具有重要应用潜力。桦褐孔菌（Inonotus obliquus）属于锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）的一种担子菌，富含多糖、多酚、三萜类化合物和黑色素。在自然生长过程中，桦褐孔菌形成不育菌核（Chaga），其黑色外层含有丰富的黑色素、多酚、三萜等活性成分，可能具有与内部组织不同的理化特性。然而，目前关于桦褐孔菌多糖的研究主要集中于整个菌核、子实体或培养菌丝体，黑色外层作为独立原料的研究相对有限，尤其在提取优化、纯化、结构表征和体外生物活性方面缺乏系统报道。因此，本研究专门以不育菌核的黑色外层为原料，系统开展多糖提取优化、纯化、结构表征及体外活性评价，以补充对该组织化学特征和生物学潜力的认识。

研究人员采用热水浸提法从桦褐孔菌不育菌核黑色外层中提取粗多糖，通过单因素实验和Box–Behnken响应面法（RSM）优化提取条件，随后利用DEAE-52离子交换色谱和Sephacryl S-400 HR凝胶过滤色谱进行纯化，获得相对均一的多糖组分（IOP）。研究人员对IOP的化学组成、分子量、单糖组成和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）特征进行了表征，并评价了其体外抗氧化、肿瘤细胞活力抑制及免疫调节活性。结果表明，在最优条件下（温度98 °C、液料比32:1 mL/g、时间173 min），粗多糖提取率达到24.64 ± 0.48%。IOP总糖含量为88.97 ± 1.33%，糖醛酸含量为10.91 ± 0.37%，未检测到蛋白质和酚类化合物。其重均分子量为78.0 kDa，单糖组成主要为葡萄糖（72.91%）、半乳糖（13.93%）、半乳糖醛酸（7.66%）和葡萄糖醛酸（5.50%）。FT-IR光谱显示典型的多糖官能团及糖醛酸特征吸收。IOP在100–1600 μg/mL范围内表现出浓度依赖的DPPH、ABTS、羟自由基（·OH）和超氧阴离子（O₂·?）清除能力，同时具有铁离子还原能力（FRAP），但活性低于阳性对照维生素C（VC）。IOP能够以浓度和时间依赖方式降低A549、SW1990、4T1和B16F10肿瘤细胞的CCK-8活力读数，且对L929成纤维细胞毒性较低；同时能促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-6和IL-1β。该论文发表在《Foods》，为深入理解桦褐孔菌黑色外层多糖的化学特征和生物活性提供了初步数据，也为后续结构解析和机制研究奠定了基础。

方法方面，样本由吉林农业大学食药用菌中心提供，并经ITS序列分析对菌种进行了鉴定。主要技术方法包括：热水浸提与乙醇沉淀获得粗多糖；单因素实验结合Box–Behnken响应面优化提取温度、液料比和时间；Sevag法脱蛋白和透析除杂；DEAE-52离子交换色谱与Sephacryl S-400 HR凝胶过滤色谱纯化多糖；苯酚-硫酸法测定总糖、BCA法测定蛋白质、硫酸-咔唑法测定糖醛酸；高效体积排阻色谱-多角度激光光散射-示差检测（HPSEC-MALLS-RID）测定分子量；高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）分析单糖组成；FT-IR分析官能团；采用DPPH、ABTS、·OH、O₂·?清除法和FRAP法评价抗氧化活性；CCK-8法检测肿瘤细胞和巨噬细胞活力；ELISA法检测NO和细胞因子分泌。

结果部分具体如下：

3.1 单因素优化：考察了提取温度、液料比和时间对粗多糖提取率的影响。结果显示，随温度升高提取率逐渐增加，100 °C时最高，但90 °C与100 °C差异不大，故选择90 °C作为响应面中心点；液料比在30:1（mL/g）时提取率达19.63 ± 0.90%，继续增加液料比不再提高提取率；时间在180 min时提取率达20.49 ± 1.09%，延长时间后提取率下降，可能与多糖降解有关。这些结果确定了响应面优化的因素水平范围。

3.2 响应面优化：采用Box–Behnken设计建立回归模型，模型显著（p < 0.0001），失拟项不显著（p = 0.6932），R² = 0.9978，调整R² = 0.9949，模型拟合良好。各因素影响顺序为温度>液料比>时间，温度与时间的交互作用显著，而温度与液料比、液料比与时间交互作用不显著。预测最优条件为98 °C、32:1 mL/g、173 min，经实验验证粗多糖提取率为24.64 ± 0.48%，与预测值24.56%非常接近，表明模型准确可靠。

3.3 提取、分离、纯化与化学组成：在最优条件下制备粗多糖，经DEAE-52离子交换色谱，以0.1 M NaCl洗脱得到主要多糖峰，再经Sephacryl S-400 HR凝胶过滤纯化获得IOP。化学分析显示IOP总糖含量为88.97 ± 1.33%，糖醛酸含量为10.91 ± 0.37%，蛋白和酚类含量低于检测范围；UV-Vis光谱在260和280 nm无吸收，进一步排除了核酸和蛋白质污染。

3.4 分子量和单糖组成：HPSEC-MALLS-RID显示IOP为单一对称洗脱峰，重均分子量为78.0 kDa。单糖组成分析表明IOP由葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，摩尔百分比分别为72.91%、13.93%、7.66%和5.50%，其中半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的存在进一步验证了糖醛酸残基。

3.5 FT-IR分析：IOP在3411.46 cm^?1处显示O–H伸缩振动峰，2925.48 cm^?1处为C–H伸缩振动，1614.13和1413.57 cm^?1分别为羧酸根的反对称和对称伸缩振动，1029.80 cm^?1归属于C–O–C和C–O–H伸缩振动，指纹区852.28和763.67 cm^?1进一步支持多糖特征。虽然1600–1650 cm^?1可能与蛋白酰胺I区重叠，但BCA法未检出蛋白且UV-Vis无280 nm吸收，说明可检测蛋白质贡献极小。

3.6 体外抗氧化活性：在无细胞化学体系中，IOP在100–1600 μg/mL浓度范围内对DPPH、ABTS、·OH和O₂·?均表现出浓度依赖性清除作用。在1600 μg/mL时，清除率分别为77.24 ± 0.30%、57.61 ± 2.01%、80.97 ± 0.27%和51.33 ± 0.66%，FRAP值为1.30 ± 0.02 μmol/mL，总体活性低于VC。这些结果反映的是IOP与化学自由基之间的直接氧化还原作用，高浓度才可测到明显效果，需谨慎解释其生理意义。

3.7 对肿瘤细胞活力的抑制作用：CCK-8检测显示，IOP在100–1600 μg/mL范围内以浓度和时间依赖方式降低A549、SW1990、4T1和B16F10细胞的活力相关读数，部分肿瘤细胞在24 h的IC50值超过最高测试浓度，说明抑制作用相对温和。IOP对L929成纤维细胞毒性较低，72 h下800和1600 μg/mL处理时细胞活力读数仍高于89%，而阳性对照吉西他滨将读数降至55%以下。由于CCK-8反映细胞代谢活性而非直接测定细胞死亡，因此这些结果仅作为初步体外依据，仍需结合其他方法验证。

3.8 对RAW264.7细胞活力和免疫活性的影响：IOP在100–1600 μg/mL处理24 h对RAW264.7细胞无明显细胞毒性，并能显著促进NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌（p < 0.01），且呈浓度依赖性。内毒素检测显示IOP内毒素含量低于检测限（<0.25 EU/mg），按最高浓度1600 μg/mL计算，理论最大内毒素浓度为0.4 EU/mL，但实际含量低于检测限。尽管如此，由于RAW264.7对内毒素高度敏感，不能完全排除微量内毒素的贡献，未来需采用内毒素中和或匹配对照实验确证。

讨论部分指出，IOP的抗氧化活性是在无细胞化学系统中测得的，高浓度效应不等同于生理功效。根据IOP分子量（78.0 kDa）计算，最高1.6 mg/mL浓度对应的理论渗透压贡献约0.0205 mOsm/L，相对于细胞培养的生理渗透压（约300 mOsm/kg）可忽略，且透析处理可去除低分子量溶质，但未直接测定培养基渗透压，残余溶质影响不能完全排除。对于肿瘤细胞活力，CCK-8读数下降不能证明细胞死亡或特定抗肿瘤机制。对于免疫调节作用，内毒素贡献无法完全排除，需进一步实验明确。总体而言，这些结果属于初步体外证据。

结论部分翻译如下：综上所述，本研究利用响应面法成功优化了桦褐孔菌不育菌核黑色外层粗多糖的提取工艺，提高了