《Molecules》：In Silico Approaches Targeting Quorum-Sensing Inhibition in Pseudomonas aeruginosa: A Systematic Review
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是一种临床相关的机会性病原体，其持久性和抗菌耐受性主要由生物膜形成和群体感应（quorum-sensing, QS）调控的毒力驱动。因此，靶向QS已成为一种抗毒力策略，可减弱病原性，而不对细菌
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是一种临床相关的机会性病原体，其持久性和抗菌耐受性主要由生物膜形成和群体感应（quorum-sensing, QS）调控的毒力驱动。因此，靶向QS已成为一种抗毒力策略，可减弱病原性，而不对细菌生长施加强烈的选择压力。本系统综述（2020–2024）分析了针对PA的QS抑制剂识别的最新进展，特别强调整合了计算机模拟（in silico）方法的研究。46项研究符合纳入标准。所有研究均采用了分子对接（molecular docking），其中36.9%（n=17）结合了分子动力学模拟（molecular dynamics simulations）。尽管这些计算预测对于初步检测有价值，但在准确估计结合能和构象动力学方面存在固有局限性，需要经验验证以确认实际生物活性。约五分之一的研究仅基于计算，其余研究将计算机模拟筛选与体外（in vitro）以及在某些情况下体内（in vivo）实验相结合。最常研究的QS调控因子是LasR、PqsR和RhlR，以及其他毒力相关蛋白。评估的化合物包括植物化学物、合成分子、纳米材料和天然产物衍生化合物，其中几种显示出生物膜衰减和QS调控毒力因子减少的实验证据。总体而言，研究结果强调了整合计算和实验策略以合理优先选择抗毒力候选物的价值。然而，QS网络的内在复杂性和冗余性表明，未来的研究应更加关注多靶点方法，并探索化学多样性和先前未被充分研究的化合物库，以提高对PA生物膜的功效。
1. Introduction
引言部分指出，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是一种临床相关机会性病原体，其持久性与生物膜形成和群体感应（quorum-sensing, QS）调控的毒力密切相关。生物膜基质主要由胞外多糖、蛋白质和胞外DNA组成，其中Psl、Pel和海藻酸盐在初始附着、结构成熟和稳定性中起关键作用。QS系统由Las、Rhl、PQS和IQS等相互连接的调控网络构成，协调毒力因子表达。针对QS抑制的抗毒力策略可减弱病原性而不产生强选择压力。计算机模拟方法，如虚拟筛选（virtual screening, VS）、分子对接（molecular docking）和分子动力学模拟（molecular dynamics simulations, MDs），已成为先导化合物优先化的重要工具，但需结合实验验证。本系统综述旨在定性综合2020–2024年间采用计算机模拟方法识别PA QS抑制剂的研究，重点关注计算策略、分子靶标、实验验证路径及未来多靶点抗毒力方法。
Quorum-Sensing System in Pseudomonas aeruginosa
PA的QS网络由Las、Rhl、PQS和IQS四个系统组成，通过激活和交叉调控机制相互作用。Las系统占据主导调控地位，控制Rhl和PQS系统；Rhl作为关键效应模块，调控生物膜结构和分散；PQS系统整合毒力调控与铁代谢；IQS系统连接环境压力信号（如磷酸盐限制）与经典QS回路，确保在LasR突变等情况下仍能维持QS调控。这种网络冗余性凸显了单靶点抑制策略的局限性。
2. Results
2.1. General Overview of Included Studies
在PubMed、Scopus和Web of Science中进行系统检索，最终纳入45项研究。时间分布显示2024年发表量最大（39.1%，n=18），其次为2023年（21.7%）、2022年（17.4%）、2021年（15.2%）和2020年（6.6%）。仅19.6%的研究完全基于计算机模拟，其余结合了实验微生物学、分子和/或化学分析。在包含体外验证的研究中，最常用菌株为PAO1（58.4%），其次为ATCC菌株（10.8%）和临床分离株（5.6%）。关键词共现分析揭示了三个主要聚类：QS与毒力、计算方法、实验评估与化合物来源。
2.2. Computational Approaches and Validation Strategies
所有研究均采用分子对接，36.9%结合了分子动力学模拟。对接协议在评分函数、网格定义、配体准备和验证策略（如重对接）方面存在显著异质性，影响结果可比性。67.4%的研究使用共晶配体进行重对接验证。常用软件为AutoDock Vina 1.2.0（50%），MD常用平台为Desmond（43.8%），ADMET分析常用SwissADME（61.5%）。
2.3. Molecular Targets and Structural Modeling Strategies
最常研究的QS受体为LasR（31.4%）、RhlR（16.7%）、LasI和PqsR（各13.7%），以及QscR和RhlI（各3.9%）。此外，还包括QS相关毒力蛋白如LasA、LasB、PqsA等。对于LasR、PqsR和RhlR，使用了多种晶体结构（LasR达10种）。当实验结构不可用时，采用同源建模（SWISS-MODEL）或人工智能预测（AlphaFold）。
2.4. Origin and Chemical Nature of Evaluated Ligands
配体来源多样：23.9%来自文献报道，26.1%通过化学合成获得（如烷基咪唑、黄酮类、肉桂酸衍生物等），17.4%来自植物提取物或生物表面活性剂，21.7%来自化合物数据库，10.9%为市售天然化合物。基于对接结合亲和力的20种最 promising 配体中，3,3′-二羟基-4,5-二甲氧基联苄、lupiwighteone等表现出最负的结合能（?14.5至?13.2 kcal/mol），与LasR关键残基（Phe101、Tyr64、Trp88）形成π-π相互作用。LasR是最常被靶向的受体（75%）。
2.5. Experimental Validation of Computational Predictions
实验方法包括最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）测定、结晶紫和刚果红染色生物膜抑制试验、RT-qPCR基因表达分析、显微镜技术（光学显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、扫描电子显微镜）评估生物膜结构，以及胞外多糖和QS调控毒力因子（如绿脓菌素、脓菌素、蛋白酶）的测定。代表配体如木犀草素（luteolin）和芹菜素（chrysin）显示最低MIC（0.08和0.009 mg/mL），大黄酸（rhein）在0.15 mg/mL下抑制群集运动和多种毒力因子，氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）在300 mg/mL下达到类似抑制水平，芦丁（rutin）在0.25 mg/mL下实现73.7%的生物膜抑制。
3. Discussion
3.1. Methodological Strategies for the Identification of QS Inhibitors
所有研究均采用分子对接作为预测蛋白-配体相互作用的方法。64.1%的研究进行了重对接验证，但仅依赖重对接存在局限性，因其引入结构偏差，无法保证对新化学型的预测准确性。对接可作为预实验或后实验方法，但成功与否取决于所选受体的晶体学分辨率。分辨率低于1.2 ?为理想，1.5–2.5 ?范围常见，低于2.2 ?通常可接受。当晶体结构不可用时，采用同源建模（SWISS-MODEL）或人工智能预测（AlphaFold），但需经结构评估。
3.2. Inhibitors and Molecular Targets Associated with QS
最常研究的蛋白为LasR、PqsR、LasI和RhlR。LasI激活LasR，触发生物膜形成和毒力因子表达；RhlR调控毒力相关基因；PqsR控制pqsABCDE操纵子，产生喹诺酮分子。QS抑制剂需满足小分子尺寸、特异性、化学稳定性和抗降解性等标准。黄酮类化合物（如芹菜素、木犀草素、芦丁）通过变构抑制LuxR型受体（LasR和RhlR），干扰DNA结合，降低毒力相关基因转录。ZnO-NPs可抑制LasR和LasI，在高于MIC浓度下显著减少鼠李糖脂、绿脓菌素、弹性蛋白酶等毒力因子，并降低lasI/lasR、rhlI/rhlR、pqsA/pqsR的表达。
3.3. Limitations and Future Prospects
对接获得的结合亲和力值仅反映结构级相互作用，不代表生物活性，易产生假阳性。分子动力学模拟的可靠性依赖于力场（如AMBER、CHARMM、OPLS）和溶剂模型（如TIP3P、Generalized Born）的选择，但方法报告不一致，限制可比性。对接基于静态受体模型，未考虑构象动力学和竞争性结合环境。大多数实验研究在浮游状态或早期生物膜中进行，难以外推至成熟生物膜。未来应优先考虑多靶点方法和探索未充分研究的化合物库，以降低适应性反应风险。
4. Materials and Methods
4.1. Literature Search Strategy
本研究为系统综述，检索PubMed、Scopus、Web of Science、ScienceDirect、DOAJ和Redalyc数据库，时间范围为2020年1月至2024年12月。检索策略使用MeSH术语和自由文本关键词，通过布尔运算符连接。最终检索日期为2024年10月30日。仅考虑英文或西班牙语同行评审文章。
4.2. Eligibility Criteria
纳入标准：开放获取、以PA为靶标、至少应用一种计算机模拟方法（分子对接、虚拟筛选、分子动力学模拟）、报告QS调控因子或QS相关毒力蛋白的蛋白-配体相互作用结合亲和力值。排除标准：主要目标为疫苗设计、RNA抑制策略或非PA生物。开放获取限制可能引入选择偏倚，但确保了方法细节的可获取性。
4.3. Study Selection Process
遵循PRISMA 2020指南进行筛选，未注册PROSPERO。由于标准偏倚风险工具不适用于计算机模拟和临床前研究，采用数据提取过程中的详细方法学评估，重点关注晶体学分辨率和对接验证。所有记录经标题和摘要筛选，重复项去除后，对全文进行评估，最终保留45项研究。由于方法学异质性，未进行定量荟萃分析。
4.4. Data Extraction and Qualitative Synthesis
数据提取使用标准化电子表格，提取变量包括标题、作者、年份、化合物来源与类别、分子靶标、计算机模拟方法、结合亲和力值、验证策略、软件和服务器、实验方法、菌株和关键实验结果。进行描述性和比较分析，包括百分比、频率、关键词共现分析。
5. Conclusions
本综述表明，QS抑制剂发现的主要挑战不在于候选分子缺乏，而在于筛选策略的方法学设计。当前方法常依赖单靶点对接预测，未能充分反映PA毒力调控网络的复杂性。未来进展需整合生物基计算机模拟筛选、多靶点验证和感染相关实验模型，并强调预测性实验框架以区分真正抗生物膜候选物与计算假阳性。
