《Plants》：Advances in Genetic Transformation of Lotus corniculatus: Methodological Determinants, Applications and Future Priorities
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百脉根（Lotus corniculatus）是一种优良的豆科牧草，具有饲用、生态、观赏和药用等多种价值，也是植物生物反应器的理想材料。作为核心技术手段，遗传转化克服了传统育种的限制，促进了该物种抗逆性和农艺性状的定向改良。本综述总结了农杆菌（Agrobact
百脉根（Lotus corniculatus）是一种优良的豆科牧草，具有饲用、生态、观赏和药用等多种价值，也是植物生物反应器的理想材料。作为核心技术手段，遗传转化克服了传统育种的限制，促进了该物种抗逆性和农艺性状的定向改良。本综述总结了农杆菌（Agrobacterium）介导的百脉根遗传转化的研究进展，重点关注外植体选择、菌株选择、侵染与共培养方案、基本培养基组成、植物激素调控，以及除菌与转化体筛选策略等关键步骤。研究人员进一步阐述了该转化系统在增强非生物胁迫（盐、干旱和高温）耐受性、调控品质相关性状，以及开发植物疫苗生物反应器中的应用。此外，本文批判性地讨论了限制现有百脉根遗传转化系统的主要瓶颈与挑战，并评估了建立高效且遗传稳定的转化平台的前景。本综述旨在为百脉根的种质创新、分子育种及综合利用提供理论基础和技术参考。
论文主体内容总结如下：
1. 引言
百脉根（Lotus corniculatus）是豆科百脉根属多年生草本植物，广泛分布于温带和亚热带地区，具有重要农业、生态和景观价值。其根系发达，侧根密集，抗逆性强，可用于边际土地改良、水土保持和退化生态系统恢复。百脉根花期长，观赏价值高，耐践踏、耐荫蔽，维护成本低，抗病虫害能力强，适用于路边绿化、城市公园和郊区绿地。作为优质豆科牧草，其茎叶营养成分均衡，粗纤维含量低，可溶性碳水化合物储备充足，并富含缩合单宁，可提高适口性和饲喂安全性，减少反刍动物膨胀病。百脉根再生能力强，耐牧性佳，被视为温带地区有潜力的主要牧草种类，可部分替代白三叶（Trifolium repens）和紫花苜蓿（Medicago sativa）。百脉根开花繁茂，性状遗传稳定，细胞全能性高，可通过胚发生和不定芽分化途径高效再生植株。基于其成熟的遗传转化系统，百脉根被广泛用于探索类黄酮代谢、共生固氮和抗逆性调控机制，以及牧草品质改良。同时，它是植物生物反应器的理想受体材料，可用于生产针对口蹄疫病毒、禽流感病毒等病原微生物的兽用疫苗及多种重组治疗蛋白。此外，百脉根衍生的次生代谢物具有抗氧化、DNA保护和抗肿瘤活性，在医药和健康领域具有开发潜力。在基因组学方面，百脉根、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和百脉根属百脉根（L. japonicus）均为豆科模式植物，但百脉根因其异源四倍体基因组和自交不亲和性而区别于二倍体近缘种，因此在基因组资源、基因编辑工具和转化效率方面相对滞后。尽管具有这些有利特性，百脉根的实际生产和规模化应用仍面临瓶颈，如干旱、低温和盐碱等非生物胁迫影响田间建植，以及传统育种周期长、效率低、优良农艺性状聚合缓慢等问题。遗传转化作为现代作物育种的重要工具，与基因组选择和基因组编辑互补，是引入外源新性状的唯一可行途径。通过农杆菌介导的稳定遗传转化系统已在百脉根中成功建立并逐步完善，但转化效率低和基因型依赖性仍是限制其广泛应用的主要难题。本文基于系统性文献检索，回顾了百脉根遗传转化的主要方法和关键影响因素，总结了抗逆遗传工程和植物生物反应器应用的研究进展，识别了关键技术瓶颈，并展望了未来研究方向。
2. 百脉根遗传转化系统
目前用于百脉根的遗传转化技术主要包括农杆菌介导法和激光微束介导法，其中农杆菌介导法因其操作简便、外源基因拷贝数低（通常1-2拷贝）和世代稳定遗传而成为最成熟和广泛应用的核心技术。农杆菌菌株主要分为根癌农杆菌（A. tumefaciens）和发根农杆菌（A. rhizogenes）。根癌农杆菌介导的转化用于产生可遗传的稳定转基因系，但转化效率较低；发根农杆菌介导的转化常用于诱导毛状根，作为瞬时表达分析和根特异性性状功能研究的平台，也可直接再生为完整转基因植株。转化效率受多种因素共同调控，包括菌株、外植体类型、侵染和共培养条件以及筛选和再生系统。
2.1 外植体
外植体的选择和处置是百脉根遗传转化的关键决定因素。子叶、下胚轴、叶片、茎段和根均为常用外植体材料。在根癌农杆菌介导的转化中，子叶和下胚片是主要外植体，子叶因分化能力强、易分离且与多种菌株兼容而广泛使用。研究表明，下胚轴的转化效率略高于子叶，因此可同时使用两者。外植体的生理状态也影响效率，适宜苗龄为5-8天。超生长根（SR）系统可支持无外源植物生长调节剂的根系永久增殖和再生，从中获得叶片作为外植体。发根农杆菌介导的转化通常以带节茎段为外植体，转化频率可达74.64%，显著高于根、节间和叶片。此外，以幼枝为外植体获得的毛状根转化频率（81.1%）高于幼苗（62.2%）。
2.2 菌株选择
农杆菌菌株的毒力和宿主兼容性影响转化效率。根癌农杆菌菌株中，LBA4404、GV3101和EHA105最为常用。LBA4404毒力适中、生长稳定，实验重复性好；EHA105的转化效率显著高于LBA4404和GV3101，适用于追求最大效率的实验。发根农杆菌菌株包括A4M70GUS、LBA9402和K599，其中K599与高效SR再生系统结合时应用更广泛。
2.3 侵染与共培养
侵染菌液浓度、共培养时间和诱导物质直接影响转化效率和外植体存活率。OD
600=0.6为最优浓度，适用于多种菌株和外植体。过稀或过浓均不利。表面活性剂（如Silwet L-77）可提高转化频率，但在百脉根中尚未验证。负压辅助侵染可提高效率，如-0.05 MPa处理5分钟将EHA105转化效率从13.8%提高至19.0%。共培养时添加酚类诱导物乙酰丁香酮（AS）可激活Vir基因表达，20 mg/L AS可获得最高效率；浓度过高导致外植体坏死。共培养时间：根癌农杆菌介导的转化通常为3-7天；发根农杆菌K599介导的转化以2天为最佳，转化频率达91.5%。
2.4 基础培养基与激素
MS和B5是百脉根遗传转化中常用的基础培养基。植物生长调节剂包括生长素（2,4-D、NAA）和细胞分裂素（6-BA、激动素）。在种子萌发阶段使用无激素MS或B5培养基；共培养阶段使用MS培养基；愈伤组织诱导阶段主要使用2,4-D与细胞分裂素组合；不定芽分化阶段以细胞分裂素为主，辅以低浓度生长素，6-BA（0.1-1.0 mg/L）与NAA（0.1-0.5 mg/L）为经典配方；生根阶段使用低浓度NAA（0.0-0.1 mg/L）或不加激素，半强度MS（1/2 MS）培养基也有应用。近年来，使用液体MS培养基添加NAA和蛭石的新型生根系统可改善根际通气，提高生根率和移栽成活率。
2.5 除菌处理与筛选系统
除菌处理主要依赖头孢噻肟（200-500 mg/L）或羧苄青霉素（300 mg/L）抑制残留农杆菌生长。筛选标记包括抗生素选择（潮霉素、卡那霉素、草铵膦）和生物安全正选择系统（磷酸甘露糖异构酶PMI基因介导的甘露糖依赖系统）。抗生素选择中，潮霉素浓度为15-20 mg/L或4 mg/L，卡那霉素50-100 mg/L，草铵膦2 mg/L。PMI系统在含20 g/L甘露糖和20 g/L蔗糖的培养基上获得16.2%的转化频率。报告基因（如GUS、DsRed2、RUBY）用于辅助检测和验证转基因事件，但不直接决定存活率。
2.6 生根诱导与移栽驯化
以蛭石替代琼脂作为生根基质可改善根际微环境，提高生根率和移栽成活率。已开发出简化的四步转化方案，将伸长芽直接移栽到盆中，缩短转化周期，但尚未在百脉根中验证。根据文献，最可重复的根癌农杆菌介导方案是：用5-8天苗龄的子叶或下胚轴，以LBA4404或EHA105（OD
600=0.6）侵染，共培养3天，在含0.1 mg/L 6-BA的MS培养基上诱导芽，在MS或1/2 MS培养基上生根。发根农杆菌介导的毛状根转化：用K599（OD
600=0.6）侵染茎段，共培养2天。
2.7 基因组资源与其他百脉根属物种的转化
百脉根缺乏高质量染色体级别核基因组，可用资源仅限于细胞器基因组和272份材料的重测序/GWAS数据。二倍体模式种百脉根属百脉根（L. japonicus）具有完整的染色体级组装、多组学数据和先进的转化平台，其CRISPR/Cas9基因编辑载体和安全的PMI筛选系统可作为技术参考。此外，牧草种百脉根属狭叶百脉根（L. tenuis）的转化程序已有报道。跨种比较作图是发现百脉根直系同源基因的主要策略。
3. 百脉根遗传转化应用研究
3.1 非生物胁迫抗性遗传工程
通过成熟的转化系统，已实现抗盐、抗旱和极端温度胁迫的改良。如异源表达大豆GmNHX1维持离子稳态提高耐盐性；内源转录因子LcERF056正调控盐胁迫耐受性。AtAVP1、ZxNHX与ZxVP1-1共表达、PeDREB2a与KcERF共表达等同时增强耐盐和抗旱性。热激蛋白LcHsp70-1过表达增强高低温双重耐受性。
3.2 牧草品质与安全性改良
品质改良集中于缩合单宁（原花青素，PA）的精准调控、叶酸生物强化和氰苷（CNglc）含量调控。如草莓FaMYB1抑制PA合成降低叶片PA含量；玉米bHLH转录因子Sn促进PA积累；LcMYB5被鉴定为PA生物合成的主调控因子。叶酸生物强化通过共表达MsGCHI和MsADCS使总叶酸水平提高2.1倍（叶）和1.7倍（茎）。氰苷积累相关基因通过GWAS鉴定，但直接代谢工程尚未报道。
3.3 生物反应器
百脉根作为植物生物反应器，已成功整合口蹄疫病毒VP1和P12A-3C、禽流感病毒H5N1血凝素（HA）基因、兔出血症病毒VP60及乙肝表面抗原（HBsAg）等，实现了转基因表达，但尚未展示口服免疫原性或靶动物保护效力。此外，猪瘟病毒E2抗原基因的叶绿体定位载体已构建，但尚未证明整合和抗原积累。百脉根作为转基因牧草和疫苗生物反应器的双重身份面临GMO和药品监管标准重叠、环境隔离等挑战。
3.4 共生固氮
百脉根是首个通过遗传转化研究根瘤基因功能的豆科物种。已引入大豆豆血红蛋白嵌合基因、田菁血红蛋白基因glb3的5′上游区段、大豆凝集素基因Le1等，验证了转化可行性并揭示凝集素在宿主-共生体识别中的功能。但转化方法在提高结瘤效率或固氮能力方面的应用仍需探索。
3.5 其他应用
遗传转化还用于分析发育调控机制，如LcERF1过表达提高内源生长素水平，促进不定根形成。此外，引入Bar基因赋予百脉根对草铵膦除草剂的抗性。
3.6 转基因技术应用的考量
百脉根自交不育，主要由昆虫传粉，存在基因漂移的生物安全问题。田间试验证实种内转基因流动，但可能与近缘种存在生殖隔离。目前的转化工作主要依赖CaMV 35S组成型启动子，缺乏组织特异性和诱导型启动子。基因组重测序已鉴定出与氰苷积累和生长性状相关的候选基因，为分子育种提供支持。
4. 问题与展望
4.1 核心现有挑战
低转化效率是主要技术瓶颈，根癌农杆菌介导的转化效率持续低于20%。基因型和外植体依赖性、四倍体异染色质限制T-DNA整合、植物免疫应答、T-DNA整合机制不明、表观遗传沉默等因素均导致效率低下。组织培养程序劳动密集且重复性差，周期长达4-6个月。基因型依赖和倍性复杂性使四倍体基因编辑的等位基因编辑和纯合子恢复困难。生根和驯化阶段存在缺氧、褐变和污染问题。转基因调控精度不足，缺乏组织特异性和诱导型启动子。多基因协同调控和靶向基因编辑系统尚不成熟，尚无高效CRISPR/Cas9系统报道。实验室创新向规模化工业生产的转化有限，外源蛋白表达量低，口服疫苗的关键参数尚未验证。
4.2 未来展望
未来研究应优先四个方向：提高效率、时空精度、数据驱动优化和规模化产业整合。通过调控芽再生相关基因（如LAX1、BBM、WUS、PLT5、WIND1）的过表达可能提高再生效率，但需实验验证。物理辅助（真空渗入、超声）和简化转化流程（四步法）可提高效率。克服基因型依赖的策略包括外源施用伤口信号肽REGENERATION FACTOR1（REF1）、基因型非依赖的活体转化方法、使用三元辅助质粒或工程化农杆菌菌株，但均未在百脉根中测试。开发精准调控工具，建立组织特异性和胁迫诱导型启动子库，发展无标记转化和同源重组定点整合技术。优化CRISPR/Cas9系统，引入高保真Cas变体、碱基编辑和先导编辑技术，开发DNA-free编辑方法。推进多基因聚合改良和组学驱动育种，结合GWAS和QTL定位解析复杂性状调控网络。深化植物生物反应器应用，提高表达效率和生物安全性，推动低成本高附加值生物制品的开发。总之，在基因编辑、合成生物学和表型组学等跨学科融合推动下，百脉根有望在三个方向取得进展：完善再生方案和基因型-载体-菌株组合；加速植物生物反应器研究实现可食用疫苗的可行性和稳定性；利用新获得的基因组资源加速候选基因功能验证。克服现有技术瓶颈有赖于技术升级和对再生、T-DNA整合及代谢调控的机制探索。
