血清SERPINA3作为视神经脊髓炎谱系疾病的候选非侵入性生物标志物：蛋白质组学发现与单中心验证

《Diagnostics》：Serum SERPINA3 as a Candidate Non-Invasive Biomarker for Neuromyelitis Optica Spectrum Disorder: Proteomic Discovery and Same-Center Validation

　　

背景：疑似视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的诊断评估整合了AQP4-IgG检测、临床评估、神经影像学以及排除其他炎症性脱髓鞘疾病；然而，部分患者仍无法明确诊断，或可能被误诊为多发性硬化（MS）或其他疾病。方法：这项单中心回顾性探索性研究分析了20例MS患者和20例NMOSD患者的定量血清蛋白质组学。满足名义p<0.05以及预设倍数变化标准的蛋白质被视为探索性候选蛋白。随后，研究人员采用ELISA方法，在来自同一中心的独立非重叠队列中评估了VWF、PPBP和SERPINA3，并结合常规血液学变量进行分析。结果：在261个蛋白质条目中，34个满足探索性名义阈值和倍数变化标准，但经Benjamini–Hochberg校正后均无统计学显著性（最低q=0.0734）。VWF和PPBP在四个验证组间无显著差异。SERPINA3在各组间存在差异（Kruskal–Wallis H=44.982，p=9.34×10^?10），经Holm校正后，NMOSD组血清SERPINA3水平高于MS组、创伤性脑损伤（TBI）组和健康对照组（HC）（校正后p值分别为0.036、1.49×10^?9和1.13×10^?5）。在全ELISA队列中，NMOSD与HC比较的曲线下面积（AUC）为0.928，NMOSD与MS比较的AUC为0.800。在排除有前驱感染的参与者的事后敏感性分析中，NMOSD与MS的区分度减弱。在较小的完整病例分析中，向SERPINA3添加另一项实验室变量并未显著改善表观区分度。结论：因此，SERPINA3是一种探索性的辅助性血清生物标志物候选物，而非独立的诊断检测；需要在临床代表性队列中进行前瞻性外部验证。

**论文解读：血清SERPINA3作为视神经脊髓炎谱系疾病候选非侵入性生物标志物——蛋白质组学发现与单中心验证**

**研究背景与问题**

视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD）是一种严重的中枢神经系统（central nervous system, CNS）自身免疫性炎症性疾病，主要累及视神经和脊髓，病理机制为星形胶质细胞损伤，与多发性硬化（multiple sclerosis, MS）截然不同。然而，在临床实践中，NMOSD与MS及其他炎症性脱髓鞘疾病的鉴别诊断因重叠的临床和影像学特征而面临挑战。准确区分二者至关重要，因为治疗策略和长期预后差异显著：NMOSD急性期需高剂量糖皮质激素和血浆置换，长期需免疫抑制治疗以预防复发；而MS的某些疾病修饰疗法（如干扰素-β、芬戈莫德）可能加重NMOSD患者的病情或神经功能缺损。AQP4-IgG是NMOSD的关键血清学标志物，但相当比例的患者为血清阴性，增加了实验室支持诊断的难度。脑脊液寡克隆带（oligoclonal bands, OCBs）是MS的重要标志物，但也可出现在NMOSD中，无法独立区分二者。现有实验室指标和影像学检查对部分患者仍不足以准确诊断，而腰椎穿刺为有创操作，不适合频繁监测。因此，亟需开发非侵入性、易于重复测量的血清生物标志物，以补充现有诊断评估体系。

**研究目的与意义**

本研究旨在通过蛋白质组学筛选和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）验证，鉴定并评估候选血清蛋白，重点关注SERPINA3，探索其在支持NMOSD诊断及与MS鉴别中的潜在价值。论文发表在《Diagnostics》。

**主要关键技术方法**

本研究为单中心回顾性观察性研究，样本来源于首都医科大学附属北京天坛医院。发现队列（discovery cohort）纳入2018年1月至2020年12月期间20例NMOSD和20例MS患者的存档血清，采用串联质谱标签（tandem mass tag, TMT）标记结合液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行定量蛋白质组学分析。验证队列（validation cohort）为来自同一中心的独立非重叠队列，纳入2021年1月至2022年12月期间19例NMOSD、20例MS、20例创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）和19例健康对照（healthy controls, HCs）的血清样本。采用ELISA法检测候选蛋白SERPINA3、血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）和血小板碱性蛋白（pro-platelet basic protein, PPBP）的血清浓度，并分析常规血液学参数。

**研究结果**

**3.1 研究队列的人口学与临床特征**
发现队列中NMOSD与MS组在性别、年龄、发病年龄上可比，但NMOSD组采样时中位扩展残疾状态量表（Expanded Disability Status Scale, EDSS）评分更高（4.8 vs 2.5，p<0.001）。验证队列中四组年龄和性别分布可比；NMOSD组有6例报告前驱感染，5例AQP4-IgG血清阴性。通过比较人口学和临床特征，研究人员确认发现队列和验证队列均具有代表性，为后续分析提供了基线。

**3.2 蛋白质组学分析与候选生物标志物发现**
在261个定量蛋白质条目中，34个符合名义p<0.05和预设倍数变化标准，其中13个在MS中表达升高，21个在NMOSD中表达升高。VWF、PPBP和SERPINA3在NMOSD中表达升高，但经Benjamini–Hochberg校正后无蛋白达到统计学显著性（最低q=0.0734）。通过蛋白质组学筛选，研究人员识别出34个候选蛋白，但多重检验校正后均不显著，提示这些发现仅为产生假设的信号。

**3.3 候选生物标志物的ELISA验证**
VWF和PPBP在四组间无显著差异（VWF：Kruskal–Wallis H=0.457，p=0.928；PPBP：Welch's ANOVA F=0.416，p=0.743）。SERPINA3在四组间差异显著（H=44.982，p=9.34×10^?10），NMOSD组中位浓度最高（2092.64 μg/mL），Holm校正后显著高于MS、TBI和HC组（校正后p分别为0.036、1.49×10^?9和1.13×10^?5）。通过ELISA验证，研究人员确认SERPINA3在NMOSD中显著升高，而VWF和PPBP未重复发现阶段的信号。

**3.4 SERPINA3的诊断性能**
在全ELISA队列中，SERPINA3区分NMOSD与HC的AUC为0.928（95% CI: 0.837–0.989），以约登指数确定的最佳截断值1661.99 μg/mL，灵敏度73.7%，特异性100.0%。区分NMOSD与MS的AUC为0.800（95% CI: 0.637–0.926），截断值1845.56 μg/mL，灵敏度68.4%，特异性90.0%。排除前驱感染患者的事后敏感性分析中，NMOSD与HC的差异仍显著（校正后p=4.13×10^?5），但NMOSD与MS的区分度减弱（校正后p=0.0553），AUC降至0.753。通过受试者工作特征曲线（ROC）分析，研究人员发现SERPINA3在区分NMOSD与HC时表现良好，但区分NMOSD与MS的灵敏度不足，且前驱感染可能贡献了部分差异。

**3.5 常规血液学指标及其与SERPINA3的相关性**
在完整病例子集中，14项血液学指标（如白细胞计数、中性粒细胞计数和百分比等）在四组间存在显著差异，但经事后校正后，NMOSD与MS间无任何指标显著不同。组内Spearman相关分析显示，SERPINA3与少数指标存在名义相关（如NMOSD中与PPBP的ρ=0.629，原始p=0.028），但经Benjamini–Hochberg校正后均不显著。通过比较血液学指标，研究人员发现常规血液学参数无法区分NMOSD与MS，且SERPINA3与这些指标的相关性在多重校正后消失。

**3.6 基于SERPINA3的联合模型诊断性能**
在完整病例子集中，对于NMOSD与HC比较，SERPINA3单独AUC为0.904，联合单核细胞计数后AUC为0.943，但差异无统计学意义（DeLong p=0.394）。对于NMOSD与MS比较，SERPINA3单独AUC为0.778，联合VWF后AUC为0.799，差异亦不显著（DeLong p=0.821）。通过构建逻辑回归模型，研究人员发现添加一个额外实验室变量未能显著改善SERPINA3的鉴别性能。

**讨论与结论**

本研究通过TMT血清蛋白质组学发现与同中心独立队列ELISA验证相结合，主要发现为NMOSD患者血清SERPINA3持续升高，在区分NMOSD与MS时具有中等鉴别性能，而VWF和PPBP未重复发现阶段的信号。SERPINA3是一种急性期丝氨酸蛋白酶抑制剂，可由全身产生，也可由CNS反应性细胞表达。其在多种炎症和神经退行性疾病中升高，提示缺乏疾病特异性，但NMOSD中高于MS的水平可能反映了诱导强度、细胞来源、区室释放或时间调控的差异。鉴于AQP4-IgG相关NMOSD以星形胶质细胞为中心的病理性改变，以及SERPINA3与反应性星形胶质细胞和神经炎症反应的相关性，循环SERPINA3可能反映星形胶质细胞损伤、全身急性期激活、蛋白酶调控或这些过程的组合。排除前驱感染的敏感性分析表明，前驱感染可能部分贡献了NMOSD与MS的差异，但不能完全解释SERPINA3的发现。TBI组作为急性非自身免疫性CNS损伤对照，其SERPINA3水平低于NMOSD，提示非特异性神经损伤本身不足以解释NMOSD中的升高。SERPINA3在区分NMOSD与MS时灵敏度不足（68.4%），不支持作为独立筛查或排除试验，更合理的临床角色是作为AQP4-IgG、MOG-IgG检测、神经影像学、脑脊液发现和神经评估的辅助手段。本研究局限性包括：临床队列样本量较小且来自单中心回顾性人群，非急性期和AQP4-IgG血清阴性病例数有限，比较组中未包含独立的MOGAD组或其他炎症性神经疾病；TMT蛋白质组学实验设计存在诊断组与报告通道的混杂效应。因此，SERPINA3是探索性辅助性血清生物标志物候选物，而非独立诊断检测，需要在更大、前瞻性、多中心队列中进行外部验证。

**研究结论**：血清SERPINA3在支持NMOSD与MS的鉴别方面显示出潜在价值，但当前诊断性能不足以作为独立检测。它可能在一个包含抗体检测、神经影像学、脑脊液发现和临床评估的多模式诊断框架内提供补充信息。在临床应用前，需要进行前瞻性多中心研究，纳入临床代表性比较组，预先调整相关混杂因素，并进行独立外部验证。