综述：农业生物技术中微生物保存的冷冻干燥：机制、制剂策略与工业实施

《Processes》：Freeze-Drying for Microbial Preservation in Agricultural Biotechnology: Mechanisms, Formulation Strategies and Industrial Implementation

　　

冷冻干燥是微生物保存最有效且应用最广泛的技术之一，在可持续农业微生物生物投入品开发中扮演着日益重要的角色。除了维持微生物活性，成功的冷冻干燥制剂需要整合保存科学、制剂工程、储存稳定性和功能性能，以确保产品在工业和田间条件下的有效性。本综述讨论了冷冻干燥用于微生物保存的最新进展，重点关注细胞损伤与保护的物理化学机制、制剂策略、储存稳定性以及影响农业生物投入品开发的技术因素。此外，还强调了计算建模、系统生物学和理性制剂设计等新兴工具在优化保存系统和加速产品开发方面的最新进展。最后，讨论了与工业实施、质量保证和商业转化相关的挑战，强调了开发稳健、可规模化且有效的冷冻干燥微生物生物投入品需要多学科方法，以支持可持续和再生农业。

1. 引言
全球人口增长和粮食需求增加对农业系统构成重大挑战，要求在提高农业产量的同时确保环境可持续性。根据联合国粮农组织（FAO）的估计，到2050年农业生产需增加70-100%才能满足全球需求。尽管转基因作物和新农药开发等技术进步促进了农业生产力提升，但传统农业生产系统仍与负面环境影响以及对粮食安全和人类健康的日益担忧密切相关。此外，对农药、化肥和水资源的过度依赖在经济和环境上均不可持续，导致病原体抗性、土壤退化、环境污染以及人类和动物健康风险。这些局限性凸显了提高作物产量同时减少环境影响的创新策略的迫切需求。为此，全球向可持续农业系统的转变推动了生物投入品的使用，其中微生物生物投入品已成为维持作物生产力同时减少对化肥和农药依赖的有前景策略。同时，生物农业产品市场快速增长，反映了农业生产系统的结构性转变，将生物投入品确立为现代农业的主要趋势之一。微生物和生化生物投入品的进步，结合精准农业技术的整合，提高了这些产品在田间条件下的效率和一致性。这刺激了大型企业和初创公司对研发的投资，进一步支持了生物投入品融入综合农业生产系统。同时，制剂创新，包括微粒剂和可溶性浓缩物，正在解决与产品稳定性和兼容性相关的长期限制，从而促进其大规模采用。然而，这些产品的有效性最终取决于能够保存微生物在储存和施用后活性的制剂开发，同时在实际农业条件下维持生物功能。因此，与农业日历兼容的货架期、不同环境条件下的稳定性、与化学投入品的兼容性以及适当的施用率是产品性能和田间接受度的关键决定因素。农业生物技术的持续进步增加了对生物投入品生产中微生物培养物高效保存策略的需求。微生物的保存对于长期维持微生物培养物的纯度、活性和功能性至关重要。此外，保存技术在将敏感生物材料转化为稳定的可运输产品、延长货架期、最小化污染和生物降解风险方面发挥关键作用，从而促进微生物生物投入品的大规模分销和商业化。已开发了多种微生物保存策略，包括冷藏、冷冻保存、冷冻干燥、包封以及静电纺丝和过冷等新兴技术。其中，冷冻干燥已成为保存微生物细胞和其他生物材料在干燥状态下最广泛使用的方法之一，能够在长期储存中维持活性和功能性，甚至常在室温下实现。冷冻干燥的主要原理是降低水分可用性和微生物代谢活性，从而有助于维持微生物培养物的遗传稳定性和长期活性。冷冻干燥是一个多阶段过程，基于三个主要阶段去除物质中的水分：冷冻、真空下的升华（一次干燥）和解吸（二次干燥）。在这些阶段中，可以在最小化对生物材料化学和结构完整性损伤的同时去除水分。冷冻干燥主要从预先结构化的制剂中去除水分，因此本身不定义最终产品的粒径或结构。当需要微系统或颗粒系统时，这些特性主要由上游制剂和包封策略（如乳化）决定，这些策略在干燥前影响粒径、粒径分布和结构形态。随后冷冻干燥和干燥后操作（包括饼块破碎、研磨或过筛）中的结构变化可能进一步改变粒径分布和粉末性质。尽管在微生物保存方面取得了显著进展，但当前知识仍分散在分别研究冷冻干燥机制、制剂设计、储存稳定性和工业实施的研究中。因此，仍然缺乏整合这些方面用于农业微生物生物投入品的综合框架。特别是，对冷冻干燥的物理化学方面与农业系统中微生物生物投入品的功能性能和工业适用性的整合关注有限。尽管其他干燥技术，特别是喷雾干燥，也与微生物保存相关，并已在其他地方进行了比较讨论，但本综述特意聚焦于冷冻干燥，以提供对该保存策略的更深入分析。因此，本综述讨论了冷冻干燥应用于微生物保存的主要原理，强调了影响细胞活性、制剂稳定性、包封策略的因素，以及与商业规模生产和冷冻干燥生物投入品田间性能相关的挑战。影响冷冻干燥微生物生物投入品开发和性能的主要因素总结在图1中。

2. 微生物保存在农业生物技术中的重要性
微生物生物技术已成为现代农业和工业的战略组成部分，能够可持续生产酶、生物活性化合物和微生物生物投入品。微生物的高代谢多样性，结合其合成工业和农业利益分子的能力，扩展了其在生物肥料、植物促生根际细菌（PGPRs）、生物防治剂（BCAs）和其他生物基产品中的应用。然而，微生物产品的大规模应用不仅取决于其生物功能，还取决于开发能够维持微生物在储存和施用过程中活性、稳定性和功能性能的保存策略。在可用的保存技术中，冷冻干燥已成为长期微生物保存最有效且最广泛采用的方法之一。该过程能够保存微生物、酶、代谢物和其他生物材料，同时维持其结构完整性和生物活性在长期储存期间。这些特性对于生物肥料和生物农药尤为重要，其功效直接取决于微生物在田间条件下的活性和功能稳定性。冷冻干燥大幅降低了微生物制剂的水分活度（a_w），最小化降解反应并抑制有害微生物增殖。因此，冷冻干燥产品可在受控环境条件下储存，无需连续冷藏，从而降低物流成本并促进分销。与通常需要冷藏运输和严格冷链维护的液体生物投入品相比，冷冻干燥制剂通常具有较低的重量和体积，便于商业化分销到地理位置偏远的农业地区。然而，如果没有采用适当的制剂和储存策略，冷冻和脱水会施加严重的物理化学胁迫，可能损害细胞完整性并降低微生物存活率。因此，在长期储存中维持微生物活性和生物功能仍然是限制冷冻干燥微生物生物投入品大规模商业化的主要挑战之一，特别是在多变的环境和分销条件下。

3. 冷冻干燥过程中微生物损伤与保护机制
3.1. 冷冻干燥期间细胞损伤的来源
尽管是长期微生物保存最有效的策略之一，冷冻干燥使微生物暴露于一系列可能损害活性和功能性的物理化学胁迫。冷冻、一次干燥、二次干燥和后续储存的连续阶段施加了不同但相互关联的挑战。在冷冻过程中，冰晶形成导致冷冻浓缩、局部pH变化、相分离、渗透失衡和冰-水界面应力，而这些效应的程度受冷冻动力学的强烈影响。快速冷冻通常产生大量小冰晶，具有更大的界面面积，可能加剧细胞结构与冰相之间的相互作用，而较慢冷冻有利于形成较大晶体，从而减少吸附相关损伤。随着脱水进行，膜、蛋白质和其他细胞组分周围水化层的去除可能诱导膜破坏、蛋白质变性、氧化损伤和聚集现象。即使在干燥后，残留水分、温度波动、氧气暴露以及与包装材料的相互作用可能进一步加速储存期间的劣化。总体而言，这些内在和外在胁迫决定了冷冻干燥微生物系统的长期稳定性，并强调了在整个保存过程中精心设计保存策略的重要性。冷冻通常被视为准备步骤，但它是冷冻干燥性能的关键决定因素之一，因为冰晶形态直接影响传质阻力、干燥动力学和最终干燥产品的结构。在冷冻过程中，水分迁移在决定细胞存活中起核心作用。随着细胞外冰晶形成，未冻相中的溶质浓度增加，产生高渗环境，驱动细胞内水向外流动，这种现象称为冷冻脱水。过度冷冻脱水可能促进膜破坏、蛋白质变性和细胞功能丧失，而水分去除不足可能有利于细胞内冰晶形成和不可逆细胞损伤。冷冻还可能诱导局部pH变化、相分离现象以及未冻部分中溶质分布的变化，进一步加剧细胞应激和生物结构不稳定。异质成核发生在界面或外来颗粒存在时，降低了晶体形成所需的能量障碍，并影响冰晶的大小和分布。早期细胞外冰核形成促进受控细胞脱水并降低细胞内冰晶形成可能性，而延迟成核增加细胞内冷冻风险并损害解冻后存活。重要的是，冷冻和干燥对活性损失的相对贡献具有物种依赖性。对昆虫病原真菌的研究表明，布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）对冷冻损伤更敏感，而金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）在干燥过程中对脱水表现出更大敏感性，表明保存策略应根据目标微生物的生理特性量身定制，而非假设对冷冻干燥的普遍响应。这种区别可以通过实验解耦冷冻和干燥阶段系统评估。比较未处理对照、冷冻-解冻样品和经过完整冷冻干燥循环的样品，可以区分冷冻相关损伤与脱水过程中发生的额外损伤。这种阶段性筛选可通过膜完整性、代谢活性或细胞形态指标补充，为选择菌株特异性保存策略提供机制基础，而非仅依赖经验性制剂筛选。重要的是，最佳冷冻速率依赖于微生物和生理状态，因为细胞外冷冻脱水与细胞内冰晶形成之间的平衡随细胞结构和含水量变化。营养型细菌细胞含有相对较高的细胞内水，对此权衡特别敏感：过慢冷却可能加剧渗透脱水，而过快冷却可能限制水外流并增加细胞内冰晶形成风险。相比之下，细菌内孢子具有天然脱水的核心和专门的保护结构，使其对冷冻和干燥具有更强的内在抗性。真菌分生孢子也表现出强烈的水合依赖性响应；脱水分生孢子可能比水合形式更好地耐受冷冻，其中快速冷却可能增加对细胞内冰晶形成的敏感性。因此，冷冻方案应根据微生物分类和生理状态优化，而非假设普遍最佳冷却速率。尽管冷冻通常被视为冷冻干燥成功的主要决定因素，但越来越多的证据表明，大量细胞损伤也可能发生在干燥阶段。水分的逐步去除破坏了维持膜组织和功能所必需的水合介导相互作用。随着脱水进行，磷脂可能从液晶态转变为凝胶态，增加膜通透性并促进细胞内成分泄漏。同时，围绕蛋白质的水化层缺失可能促进构象改变、变性和聚集现象，损害生物活性和干燥后存活。因此，冷冻干燥过程中的活性损失不仅源于冷冻期间的冰晶形成和渗透胁迫，还源于与脱水相关的结构不稳定。冷冻干燥诱导的膜损伤可能进一步导致细胞内酶泄漏，包括乳酸脱氢酶和β-半乳糖苷酶，以及参与离子运输和细胞稳态的ATP酶活性降低。显微镜分析显示，用优化冷冻保护剂配方保护的细胞在冷冻干燥后保持更光滑和完整的形态，而未保护的细胞表现出严重表面塌陷、收缩和结构变形。这些发现强化了膜完整性、细胞超微结构保存与干燥后活性之间的密切关系。除脱水诱导损伤外，氧化应激是冷冻干燥和储存期间的另一重要损伤来源。氧气暴露可能促进膜脂质过氧化、蛋白质变性和其他细胞损伤，随时间推移逐渐降低微生物活性。最近的转录分析进一步表明，冷冻干燥激活了氧化应激防御系统、分子伴侣和冷休克蛋白，突显了保存过程中氧化、热和蛋白毒性胁迫的同时发生。除了直接细胞损伤，干燥基质的物理稳定性也在微生物存活中起关键作用。结构转变如脱玻化增加了分子流动性，加速了储存期间的劣化反应，从而即使在成功干燥后也导致长期活性损失。因此，维持整个储存过程中非晶玻璃态被认为对保存冷冻干燥生物系统的稳定性至关重要。冷冻干燥和储存期间影响微生物的主要物理化学和生物胁迫、其细胞靶标及生物效应示意性总结在图2中。

3.2. 保护机制
冷冻干燥过程中的细胞保护取决于制剂辅料和内在生理适应性的联合作用，以减轻冷冻、脱水和储存施加的物理化学胁迫。在制剂衍生机制中，最初为解释二糖保护作用而提出的两个互补假设已成为理解冷冻干燥过程中微生物稳定的概念基础。水替代假说认为，海藻糖等糖类与膜磷脂和蛋白质形成氢键，替代水的结构作用，从而维持敏感细胞组分的完整性。分子模拟进一步支持了这一机制，表明海藻糖和蔗糖通过改变氢键网络、减少脱水诱导的脂质有序化以及维持膜流动性更接近水合双层状态，从而在脱水过程中保护膜组织。尽管水替代仍然是二糖保护作用最广泛接受的解释之一，但其贡献不能通过通用脱水阈值与玻璃化分离。相反，两种机制是互补的，其相对贡献随残留水分含量、基质组成和物理状态而变化。当浓缩基质进入分子流动性被强烈限制的非晶玻璃态时，玻璃化变得愈发相关。从实际角度看，玻璃化转变温度（T_g）与残留水分和储存温度一起考虑，为评估这一转变提供了比固定水分含量阈值更有用的物理标准，因为当系统接近或超过T_g时，分子流动性显著增加。增加的粘度和降低的分子流动性抑制了冰重结晶，稳定了细胞结构，并在整个干燥和储存过程中最小化了机械和化学损伤。支持这一机制的实验证据已在重组Komagataella phaffii中报道，其中海藻糖和麦芽糖提高了冷冻干燥后的存活率，同时在长期储存期间保持了重组酶活性。重要的是，微生物稳定性不仅取决于这种玻璃基质的形成，还取决于其在储存过程中的维持，因为脱玻化增加了分子流动性并加速了劣化反应，最终降低生物活性和长期稳定性。除了制剂衍生保护，微生物存活还受到干燥前获得的内在生理适应性的强烈影响。细胞内海藻糖的积累与增强的冷冻干燥耐受性一致相关，如在生物防治酵母Cryptococcus laurentii中所示，其中增加的细胞内海藻糖提高了冷冻干燥和后续储存期间的存活率，特别是与外部保护剂结合时。同样，细胞在干燥前的生理状态显著影响保存结果。在碳限制条件下收获的生物防治酵母Pichia anomala细胞表现出比非胁迫培养物更高的冷冻干燥后存活率，表明干燥前的代谢状态可能与制剂组成一样重要，决定保存成功。最近，适应性实验室进化已成为增强内在细胞稳健性的补充策略。在受控氧化胁迫下选择促进了胞内和胞外多糖的积累，导致对冷冻干燥的耐受性增加并改善储存稳定性。类似地，胁迫预处理策略，如冷适应，进一步增强了细胞内海藻糖积累、微生物存活、储存稳定性和生物防治性能。总体而言，这些发现表明，成功的冷冻干燥保存依赖于外在制剂保护与内在微生物胁迫耐受性之间的相互作用。虽然水替代和玻璃化构成了脱水过程中保护细胞结构的主要物理化学机制，但干燥前的微生物生理学关键影响细胞承受冷冻、脱水和长期储存的能力。未来的保存策略可能整合优化制剂与靶向增强微生物稳健性，结合辅料设计和生理工程中的进展，以最大化冷冻干燥微生物系统的稳定性和功能性。

3.3. 保护剂及其作用方式
为最小化与冷冻、脱水和后续储存相关的物理化学胁迫，已将多种保护剂纳入微生物制剂，以提高细胞存活率并维持生物功能。其有效性不仅取决于单个化合物的内在特性，还取决于它们在制剂基质中的相互作用，因为壁材组成直接影响水分含量、玻璃化转变温度、粘性、结构完整性和长期储存稳定性。因此，最终干燥产品中围绕微生物细胞的完整制剂基质本身可能有助于保存，其集体物理化学性质应与单个辅料的保护作用一起考虑。冷冻干燥中使用的保护剂包括主要减少冷冻诱导损伤的冷冻保护剂和在脱水及储存期间稳定微生物的冻干保护剂。渗透性冷冻保护剂，如甘油，扩散进入细胞质，减少细胞内冰晶形成并降低水溶液的冰点，而非渗透性化合物主要在细胞外环境中起作用，限制冰晶生长并减少渗透胁迫。由于渗透性冷冻保护剂在高浓度下可能表现出细胞毒性，非渗透性化合物，特别是碳水化合物，因其高生物相容性和抑制冰重结晶的能力而变得愈发有吸引力。在干燥过程中，冻干保护剂通过氢键与膜和蛋白质形成，进一步稳定细胞结构，从而补充冷冻期间建立的保护。这些化合物的保护功效不仅限于防止脱水期间的结构损伤。实验证据表明，成功的冷冻保护与降低的膜通透性、保存膜相关ATP酶活性、保留细胞内酶活性以及维持再水化后的细胞超微结构密切相关。这些观察表明，有效制剂不仅保存细胞完整性，还保存微生物恢复所需的基本生理功能。此外，最近的比较研究表明，碳水化合物的保护性能受其分子结构的强烈影响。立体化学、分子构型和官能团的差异显著影响脱水耐受性，L型糖类通常优于其D型对应物，而糖醇通常比相应的单糖提供更大保护。这些发现强调，保护功效不仅取决于化学类别，还取决于支配与细胞结构相互作用的微妙分子特征。除了单个辅料的内在特性，制剂性能还受到保护剂之间协同相互作用的强烈影响。越来越多的证据表明，多组分制剂通常优于单一化合物系统，因为不同辅料贡献互补的稳定机制。例如，蔗糖、MgSO₄、脱脂乳、海藻糖、甘露醇和谷氨酸钠的组合通过同时促进水替代、玻璃化、膜稳定化和干燥基质结构增强来改善微生物存活。同样，将麦芽糊精与胶或蛋白质结合的混合壁材系统因其能够整合麦芽糊精的有利干燥性质与其他生物聚合物的乳化、界面和抗氧化功能而受到越来越多的关注。这种组合改善了粉末回收率、降低了粘性、增强了包封效率，并提高了储存期间的微生物稳定性。最近，统计优化方法，包括响应面法和混合设计策略，已能够根据目标微生物的生理需求和预期储存条件理性选择保护剂组合，从而强化了从经验性制剂筛选向预测性和知识驱动型制剂设计的转变。保护剂并非随着浓度增加而提供成比例的好处。虽然不足的浓度可能无法充分保护细胞，但过高的量可能诱导渗透胁迫、蛋白质聚集或不良的物理化学变化，最终降低微生物存活率。同样，不同类别的辅料（包括糖类、多元醇、氨基酸、蛋白质和聚合物）通过不同但互补的机制贡献，如氢键、优先相互作用、抗氧化活性、分子流动性调节、膜稳定化和非晶基质增强。因此，成功的制剂设计需要根据微生物生理学和预期应用平衡保护剂的浓度、组合和物理化学性质。表1总结了当前用于微生物冷冻干燥的主要保护剂类别、作用机制、优势及局限性。

4. 增强微生物储存稳定性的策略
微生物生物投入品在田间的有效性不仅取决于制剂质量，还取决于施用前的适当储存和处理。货架期是指在规定储存条件下生物产品保持其质量、稳定性、微生物活性和功能性能的时期。因此，影响储存期间微生物稳定性的因素直接影响产品性能，并可能损害生物技术在田间条件下的有效性。从商业角度看，微生物产品应理想地维持活性和功效接近两年。因此，在保持生物活性的同时延长货架期仍是微生物制剂开发的主要目标之一。

4.1. 环境与储存因素
温度、水分含量、水分活度和氧气暴露是决定冷冻干燥微生物稳定性的最重要环境变量。高温加速蛋白质变性、膜损伤和微生物灭活，而过量湿度可能促进污染或孢子过早萌发。相反，极低水分水平可能加剧细胞脱水和氧化损伤。水分活度也起关键作用，因为较高值下的分子流动性增加加速了化学降解反应并降低了储存期间的微生物存活率。水分活度、储存温度和干燥基质的物理状态并非独立作用，而是相互作用决定长期稳定性。增加的水分活度逐步降低玻璃化转变温度（T_g），增加了储存温度接近或超过T_g的可能性。在这些条件下，分子流动性增加，非晶基质经历结构松弛，结晶事件变得更可能，最终加速生物系统的劣化。相反，过低的湿度水平也可能有害，通过破坏生物分子与周围基质之间的稳定相互作用。因此，最大稳定性通常在残留水分的优化范围内实现，其中分子固定得以维持而不诱导过度脱水胁迫。尽管没有适用于所有冷冻干燥微生物的通用残留水分规范，但最佳值通常在低个位数范围内，约2-6%（w/w），取决于微生物、制剂基质和储存条件。超过此制剂特异性最佳值的水分水平可塑化非晶基质，降低T_g，并加速分子流动性和降解，而低于最佳值的值可能去除结构重要的结合水并破坏膜和蛋白质组织。最近的证据进一步表明，储存稳定性通过玻璃化转变温度（T_g）与储存温度（T_s）之间的关系比单独T_g更准确地预测。在干燥的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）细胞中，当温度差（T_g - T_s）降至临界阈值以下时，存活率显著下降，表明将储存温度维持在足够低于T_g的水平可最小化分子流动性并增强长期保存。同样，在储存过程中维持非晶玻璃态至关重要，因为脱玻化增加了分子流动性并加速了劣化反应，即使在初始表现出相对较高T_g值的制剂中也是如此。因此，长期稳定性不仅取决于制剂组成，还取决于对储存温度和湿度的仔细控制，以防止损害微生物活性的结构转变。除了物理不稳定性，多种化学降解过程导致储存期间的活性损失。氧化应激促进膜脂质氧化和活性氧积累，损害细胞完整性和代谢活性。其他劣化机制包括聚集、美拉德反应、水解、脱氨和其他化学修饰，逐步降低生物稳定性。因此，包装系统在限制暴露于氧气、水分以及必要时光照方面发挥重要作用，从而减少加速储存期间劣化的环境因素。在可用的保存技术中，真空包装和改良气调包装（MAP）被广泛用于改善储存稳定性。真空包装减少氧气可用性，限制氧化反应和需氧污染物增殖。MAP是一种更先进的策略，基于用受控气体混合物（通常含氮气和二氧化碳）替代大气空气，从而减少氧化应激并减缓微生物代谢。MAP与低温储存的结合已显示出对微生物保存的协同效应，而工业包装技术的最新进展进一步增加了其大规模商业应用的潜力。长期稳定性不仅取决于制剂设计和储存条件，还取决于干燥前微生物的生理状态。预处理策略如渗透胁迫、营养限制和温度适应激活细胞防御反应，增强对脱水和后续储存的耐受性。例如，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）EPS62e的渗透适应促进了相容溶质的积累，包括甘氨酸甜菜碱、海藻糖、N-乙酰谷氨酰胺谷氨酰胺和葡萄糖基甘油，从而在低湿度条件下改善了存活率、储存稳定性和生物功效。同样，营养限制和冷适应已与通过保护性代谢物积累和应激反应通路激活增强的冷冻干燥耐受性相关联。这些发现强化了最大化储存稳定性需要整合优化制剂、适当储存条件和保存前微生物生理调节。

4.2. 超越储存的功能保存
成功的微生物保存不仅限于维持干燥后或储存过程中的活性。对于冷冻干燥生物投入品，保存最终应通过微生物在重组后恢复生理活动并在到达作用位点前维持生物功能的能力来评估。因此，保存策略应涵盖储存稳定性以及保存后恢复、递送和施用。重组后的恢复是恢复微生物功能的第一个关键步骤。存活冷冻干燥的细胞经常表现出亚致死损伤，需要生理修复。在实验室条件下，营养丰富的再水化培养基与单独用水相比，一贯与改善的微生物活性恢复相关，表明重组条件直接影响代谢活性细胞的恢复。然而，营养丰富的再水化不一定反映实际农业应用，因为可湿性微生物粉末通常设计用于在喷雾前分散或悬浮于水中。因此，制剂开发还应在应用相关的重组条件下评估微生物恢复，以确保在现实田间使用场景中维持活性和功能性。成功恢复后，在递送和施用过程中维持微生物功能变得同样重要。后处理技术，特别是保护性涂层和包封系统，已成为在重组后保持生物性能的有前景方法。在农业应用中，这些保护系统可以减少环境暴露，增强生物活性化合物的保留，促进微生物递送，并延长抗菌活性。例如，由Streptomyces philanthi产生的冷冻干燥抗真菌代谢物掺入聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K90）涂层中，在室温储存条件下有效抑制了玉米粒中的真菌生长和黄曲霉毒素产生长达五个月。对于活微生物，农业包封系统提供了一种补充策略，通过创建保护性基质，促进微生物在环境条件下的存活和受控释放。例如，Panichikkal等人将地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）包封在添加壳聚糖纳米粒和米淀粉的海藻酸盐微球中，提供了用于逐步细菌释放的保护基质，并在与土壤接触后展示了有效的微生物功能。此类递送系统必须专门针对农业环境设计，其中pH、温度和湿度的波动，以及与本地微生物群落的相互作用，与胃肠道应用中的条件显著不同。总之，这些研究表明，保存微生物功能超出了货架期的考虑，包括针对预期环境设计的递送策略，并能够在目标位点维持生物活性。最终，微生物生物投入品的成功保存不能仅通过活细胞计数评估。配制后的微生物即使在长期储存后也可能保持与新鲜培养细胞相当的性能。例如，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CPA-8的冷冻干燥和流化床喷雾干燥配方尽管经历了干燥和长期储存，仍维持了对采后真菌病原体的拮抗活性。这些发现强化了活性本身不一定预测产品性能，并强调了在制剂开发、储存和施用过程中评估功能性状的重要性。

5. 用于理性设计和优化微生物保存的计算工具
传统上，冷冻干燥微生物制剂的开发严重依赖对冷冻保护剂和工艺条件的经验性筛选。计算化学、系统生物学和人工智能的最新进展已能够向更理性的设计方法转变，其中分子相互作用、制剂变量和保存方案可在实验验证前预测和优化。通过将计算建模、过程数据和实验验证整合到统一开发框架中，这些方法提供了对冷冻保护剂性能的机制见解，同时大幅减少了优化微生物保存系统所需的时间、成本和实验工作量。

5.1. 分子水平建模
密度泛函理论（DFT）已成为研究冷冻保护剂-水分子水平相互作用的宝贵计算工具。通过估算溶质自由能、氢键能力和分子稳定性等物理化学参数，DFT计算能够预测不同化合物在冷冻条件下稳定水溶液系统的有效性。使用该方法，Ashikhmina等人证明蔗糖在评估的化合物中表现出最有利的溶剂化特性，该预测随后通过实验冷冻干燥测定得到确认。然而，随着制剂复杂性和系统规模增加，传统DFT的适用性愈发受限，因其计算成本高。因此，DFT非常适合研究单个冷冻保护剂、水分子或代表性分子片段之间的特定相互作用，但对包含蛋白质、多糖、糖类和其他成分的复杂多组分基质的直接原子表示在计算上仍具挑战性。对于此类制剂，DFT在与互补方法（如分子动力学、统计优化和实验验证）整合时最具信息性，而非用于建模完整保护基质。除了预测冷冻保护剂性能，计算方法还提供了关于冷冻保护分子基础的重要机制见解。通过整合分子动力学模拟、DFT计算和互补实验分析，Kratochvílová等人证明不同冷冻保护剂通过涉及氢键动力学、冰结晶调节以及与周围水分子特定相互作用的独特机制稳定细胞。通过将理论预测与冰晶形态和解冻后细胞活性相关联，作者展示了计算建模可以揭示仅通过实验方法难以阐明的保存机制。计算建模还在实验验证前实现了新型冷冻保护化合物的理性筛选。结合量子化学和分子动力学模拟，Hayashi等人根据渗透调节特性、膜相互作用和预测保存潜力评估了40种候选分子。这种虚拟筛选策略识别出几种性能优于DMSO的化合物，说明了计算工具如何加速冷冻保护剂发现，同时大幅减少对经验性筛选的依赖。在制剂水平，计算辅助实验设计进一步强化了理性制剂开发。例如，响应面法已成功应用于优化生物防治酵母Wickhamomyces anomalus的多组分冻干保护剂配方，从而提高了冷冻干燥后存活率并维持了储存期间的生物防治功效。这些发现表明，将计算预测与统计优化整合为微生物保存系统提供了高效框架，同时减少了实验时间、成本和制剂复杂性。

5.2. 系统生物学与多组学
虽然分子水平建模预测保护性化合物与水分子之间的相互作用，但系统生物学旨在理解微生物自身如何响应保存胁迫。通过整合基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，多组学方法提供了关于支配冷冻干燥耐受性的分子网络的全面视图，从而能够识别与微生物存活和功能性相关的应激反应通路、代谢适应和生物标志物。最近的研究说明了这些方法在阐明保存机制方面的力量。Lee和Lee证明冷冻干燥显著改变了细胞内代谢物谱，将脯氨酸和谷氨酸确定为与干燥后存活相关的关键代谢物。同样，Li等人结合转录组和代谢组分析表明，胞外多糖介导的冷冻保护涉及膜完整性、能量代谢、氧化应激反应和相容溶质代谢的协调调控。总体而言，这些发现表明，多组学方法将微生物保存的评估扩展到了传统活性测量之外，提供了支持理性开发更稳健微生物制剂的机制见解。然而，从工业角度看，全面的多组学分析目前不太可能直接用作常规实时质量控制或批次放行工具，因为其分析复杂性、成本和数据处理要求。更实用的策略是在工艺开发中使用多组学来识别和验证与微生物稳健性、活性或功能性相关的一组有限生物标志物。一旦验证，选定的生物标志物可转移到靶向分析测定中，包括聚焦的代谢物、蛋白质或核酸测量，这些更易于标准化质量控制工作流程。同时，将这些生物指标与传统过程测量、实时监测和预测分析整合，可能支持未来更具响应性的质量控制框架的发展。因此，多组学在近期的工业价值主要在于生物标志物发现和过程理解，而非对每个生产批次进行全面的组学分析。

5.3. 过程水平建模与实验整合
虽然分子模拟提供对冷冻保护剂行为的机制见解，多组学方法阐明微生物应激反应，过程水平建模将计算分析扩展到整个保存系统的优化。多物理模拟可以预测干燥和储存期间的水分迁移、环境梯度、热质传递和其他物理化学现象。结合有限元建模的实验研究已成功描述了不同保存条件下生物材料的变化，展示了模拟与观察结果之间的良好一致性。尽管这些方法主要应用于食品系统，但将其适应于冷冻干燥微生物制剂代表了一个有前景的机会，可优化干燥方案、包装策略和长期储存稳定性，同时减少与传统试错方法相关的实验负担。将这些模型适应于高密度微生物生物质饼块需要重新校准材料特定的传输和结构参数，而非直接转移来自食品基质的值。特别是，实验确定的饼块密度、孔隙率和孔隙连通性、渗透性或蒸汽传输阻力、热导率、热容、水分依赖性扩散系数以及自由水与结合水分数应被纳入，因为这些性质支配了升华和解吸期间的局部热质传递。制剂特异性玻璃化转变温度和塌陷温度也应作为热约束纳入，而初始细胞和固体浓度必须考虑，因为它们影响饼块微观结构和传输阻力。对于微生物产品，这些物理化学参数还应与生物约束耦合，特别是与细胞活性或功能性丧失相关的温度-水分条件。从工业角度看，这些计算方法的转化将需要逐步工作流程，其中虚拟筛选首先在实验室规模通过实验验证，然后在中试规模工艺条件下验证，并与可测量的关键工艺参数和质量属性整合。简化的实验验证模型可随后纳入过程监测和决策支持框架，而非在常规制造中依赖计算密集型模拟。最终，成功的工业实施将取决于模型跨制剂和生产规模的验证、标准化数据采集，以及展示足够稳健性和预测准确性用于工艺设计和质量控制。分子建模、系统生物学、过程水平模拟和实验验证的整合为新一代理性保存策略提供了基础。这些互补方法而非仅依赖经验性筛选，能够实现保护剂的预选、制剂和工艺参数的优化，以及在广泛实验室实验前预测保存性能。展望未来，整合分子模拟、多组学数据集、实时过程监测和预测分析的统一计算平台预计将支持微生物保存系统的持续优化。此类数字框架有潜力加速制剂开发、降低实验成本、提高可重复性，并促进更稳健、可扩展和面向应用的微生物生物投入品的设计。图3整合了微生物生理学、制剂工程、计算建模和过程优化的进展，形成了冷冻干燥微生物生物投入品理性开发的框架。

6. 冷冻干燥对生物投入品制剂的影响
如图3所示，微生物生物投入品的开发扩展了冷冻干燥过程中保存微生物活性的范围。成功的制剂必须同时确保微生物稳定性、技术质量、可制造性、储存稳定性和田间性能。从这个角度看，制剂不应仅被视为干燥前的最后一步，而应被视为整合微生物保存与农业产品物理化学、技术和实际要求的战略阶段。因此，制剂成分的理性选择应同时考虑微生物保护、粉末质量、储存稳定性、与施用系统的兼容性以及预期农业用途。在此框架内，冷冻干燥不仅通过决定微生物存活率，还通过决定最终产品的物理化学特性发挥核心作用。在冷冻和升华过程中，高度多孔干燥基质的形成直接影响颗粒形态、密度、水分含量、吸湿性、润湿性、分散性、流动性和再水化行为。总体而言，这些属性决定了产品稳定性、处理、运输、储存和田间应用，使物理化学表征成为冷冻干燥微生物生物投入品理性开发中必不可少的组成部分。冷冻干燥制剂的结构特性受工艺参数强烈支配，包括冷冻速率、搁板温度、腔室压力和残留水分含量。这些变量决定了基质孔隙率、密度和对结构塌陷的敏感性，从而直接影响传质、水分去除和再水化效率。维持高度多孔结构尤为重要，因为过度塌陷降低了水分吸收，可能损害长期稳定性和产品性能。因此，冷冻干燥条件的优化应针对不仅微生物活性，还针对