《Bioactive Materials》：A dual-targeting mRNA lipid nanoparticle restores ABCA1-dependent cholesterol homeostasis to promote repair of age-related bone defects
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胆固醇调节自噬和衰老，但其在骨髓间充质干细胞（BMSC）衰老中的作用仍不清楚。研究人员证明，ABCA1棕榈酰化（palmitoylation）与其溶酶体定位和溶酶体相关胆固醇转运相关，从而促进自噬抑制、衰老和成骨障碍。然而，直接干扰ABCA1棕榈酰化会损害通过
胆固醇调节自噬和衰老，但其在骨髓间充质干细胞（BMSC）衰老中的作用仍不清楚。研究人员证明，ABCA1棕榈酰化（palmitoylation）与其溶酶体定位和溶酶体相关胆固醇转运相关，从而促进自噬抑制、衰老和成骨障碍。然而，直接干扰ABCA1棕榈酰化会损害通过质膜定位的ABCA1介导的胆固醇外排，增加细胞胆固醇积累，并抑制成骨。为了选择性去棕榈酰化溶酶体ABCA1，研究人员设计了一种溶酶体靶向的去棕榈酰化酶，RAB7-APT2（RA），通过将RAB7与ABCA1的主要去棕榈酰化酶APT2融合。合成了衰老细胞靶向的低炎症脂质体以递送RA mRNA，产生双靶向脂质纳米粒（LNP@A）。LNP@A选择性调节溶酶体ABCA1定位，减少溶酶体胆固醇积累，恢复自噬，并减轻衰老BMSCs的衰老。因此，LNP@A在体外增强成骨，并在老龄大鼠缺损模型中改善骨再生。这些发现揭示了ABCA1空间调控在BMSC衰老中的作用，并为年龄相关骨再生提供了靶向策略。
**研究背景与问题**
全球65岁以上人口预计到2025年将达15亿，年龄相关性骨质疏松和骨缺损不愈合成为重大公共卫生问题。胆固醇通过调节细胞膜流动性及微结构域形成，在衰老相关疾病中发挥关键作用，其中胆固醇介导的自噬抑制尤为突出：胆固醇支持mTORC1复合物活性，在营养充足或衰老条件下维持mTORC1高活性并抑制自噬。既往研究表明，衰老骨髓间充质干细胞（BMSCs）自噬水平降低，恢复自噬可增强其成骨潜能，而抑制自噬则加速细胞衰老。然而，胆固醇代谢是否参与衰老BMSCs中自噬下降，以及其潜在机制和涉及的转运体尚不清楚。此外，蛋白质棕榈酰化（palmitoylation）是调控膜蛋白定位的关键翻译后修饰，但传统广谱棕榈酰化抑制剂因非特异性作用而干扰正常细胞生理过程。因此，需要开发更精准的靶向棕榈酰化调控策略，以恢复BMSCs的成骨潜力，促进年龄相关骨缺损愈合。
**研究内容与结论**
研究人员在本研究中揭示了胆固醇代谢紊乱与自噬异常之间的表型关联，阐明了ABCA1通过棕榈酰化/去棕榈酰化循环在细胞器间转运的分子机制，并基于此开发了双靶向mRNA脂质纳米粒LNP@A，通过选择性干预溶酶体ABCA1、恢复自噬和胆固醇稳态，在体外和体内增强了衰老BMSCs的成骨能力，促进老龄大鼠骨缺损修复。该研究发表于《Bioactive Materials》。
**关键技术与方法**
1. **转录组学与功能验证**：对年轻和衰老BMSCs进行转录组测序，结合基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，筛选胆固醇代谢相关差异基因，并通过短发夹RNA（shRNA）敲低和过表达验证ABCA1在自噬抑制中的作用。
2. **细胞器分离与生化分析**：采用Cell Surface Biotinylation and Isolation Kit分离质膜蛋白，Lysosome Enrichment Kit和Golgi Extraction Kit分别富集溶酶体和高尔基体，结合免疫印迹分析ABCA1在不同细胞器中的分布；利用酰基-生物素交换（ABE）法检测ABCA1棕榈酰化水平。
3. **工程化酶设计与递送系统构建**：将RAB7序列与APT2融合构建RAB7-APT2（RA）基因，通过微流控技术将RA mRNA封装于含AE105靶向肽的脂质纳米粒（LNP@A）中，利用动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）和琼脂糖凝胶电泳进行表征。
4. **体内动物模型**：构建老龄SD大鼠（12月龄）股骨髁缺损模型，局部注射LNP@A，通过micro-CT、组织学染色（H&E、Masson三色）和免疫荧光/免疫组化评估骨再生和分子标志物变化。
**研究结果**
**2.1 衰老BMSCs中胆固醇水平升高通过抑制自噬加剧细胞衰老**
研究人员通过菲律宾菌素（Filipin）染色和酶学检测发现衰老BMSCs细胞内胆固醇水平显著高于年轻BMSCs；使用甲基-β-环糊精（MβCD）耗竭胆固醇可降低p21、p53和SA-β-gal阳性率，而胆固醇刺激则相反。mCherry-GFP-LC3标记显示衰老BMSCs自噬体减少，免疫印迹证实胆固醇刺激抑制自噬和线粒体自噬，而MβCD恢复之。自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin）逆转胆固醇诱导的衰老标志物升高，而自噬抑制剂氯喹（CQ）阻断MβCD的改善作用，表明胆固醇通过抑制自噬加剧BMSCs衰老，进而削弱其成骨能力。
**2.2 胆固醇转运体ABCA1通过激活mTORC1抑制衰老BMSCs自噬**
转录组分析显示衰老BMSCs中胆固醇代谢相关基因显著变化，其中ABCA1、ABCG1和ABCA5表达升高；仅敲低ABCA1可增加自噬体形成和线粒体自噬，并改善线粒体膜电位。免疫荧光和免疫印迹表明，ABCA1敲低减少mTOR与溶酶体共定位，降低mTORC1活性（p-s6k、p-mTOR水平下降），恢复LC3II和PINK1/PARKIN表达；ABCA1过表达则相反，且雷帕霉素可逆转此效应。进一步发现衰老BMSCs溶酶体中ABCA1丰度升高，ABCA1过表达增加溶酶体胆固醇积累，而敲低则减少。但敲低ABCA1同时降低胆固醇外排率，导致细胞内胆固醇整体升高。
**2.3 ABCA1定位由棕榈酰化/去棕榈酰化循环调控**
ABE实验证实ABCA1存在棕榈酰化，主要棕榈酰化酶DHHC8（ZDHHC8）过表达增强其棕榈酰化，广谱抑制剂2-溴棕榈酸（2BP）则阻断之。细胞器分离显示，2BP减少溶酶体和质膜ABCA1，增加高尔基体ABCA1；去棕榈酰化酶筛选发现APT2是ABCA1的主要去棕榈酰化酶，免疫共沉淀验证两者相互作用。APT2过表达减少溶酶体和质膜ABCA1，增加高尔基体ABCA1，降低溶酶体胆固醇，但抑制胆固醇外排；去棕榈酰化抑制剂Palmostatin B则相反。通过定点突变ABCA1三个主要棕榈酰化位点（C3S/C23S/C1110S/C1111S），突变体几乎完全丧失棕榈酰化，导致其滞留于高尔基体，减少溶酶体和质膜定位，并抑制mTORC1活性。此外，构建转运缺陷突变体（A937V）后，溶酶体胆固醇积累显著降低，且APT2过表达不再影响溶酶体胆固醇，表明ABCA1以棕榈酰化依赖方式作为溶酶体胆固醇输入器。
**2.4 工程化细胞器靶向去棕榈酰化酶将ABCA1从溶酶体重新导向质膜**
研究人员将RAB7序列连接至APT2羧基端构建RAB7-APT2（RA），免疫荧光显示RA与溶酶体共定位显著高于APT2。细胞器分离表明，RA减少溶酶体ABCA1，但增加质膜ABCA1和高尔基体ABCA1，而APT2则减少所有膜组分。RA处理降低溶酶体胆固醇，提高胆固醇外排率，降低细胞内胆固醇；高尔基体转运抑制剂布雷菲德菌素A（BFA）阻断RA对质膜ABCA1的提升作用，证实RA释放的溶酶体ABCA1经高尔基体再棕榈酰化后返回质膜。RA较APT2更有效地抑制mTORC1活性，恢复自噬和线粒体自噬，降低SA-β-gal、p21/p53和SASP因子表达。ABCA1敲低或自噬抑制剂CQ处理消除RA的抗衰老效应，表明RA通过ABCA1依赖的机制恢复自噬进而改善衰老。
**2.5 负载RA mRNA的LNP@A的合成与表征**
研究人员将DMG-PEG2000-NHS与衰老细胞标志物uPAR（尿激酶型纤溶酶原激活物受体）靶向肽AE105共价偶联，合成DMG-PEG2000-AE105。以4A3-SC8、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000-AE105为脂质相，RA mRNA为水相，通过微流控技术制备LNP@A。DLS显示粒径约140 nm，PDI<0.3，zeta电位>30 mV，TEM证实均匀球形；血清稳定性和储存稳定性良好，且不同批次间重现性佳。CCK8和活死细胞染色表明3.0 μg/ml浓度下无明显细胞毒性，且4A3-SC8基LNP@A不诱导显著炎症因子表达。Cy5标记显示含AE105的LNP@A被衰老BMSCs高效内吞，并具备良好内体逃逸能力。免疫印迹显示RA蛋白在LNP@A处理后1-3天高表达，第7天基本消失，且RA主要定位于溶酶体。LNP@A处理显著促进ABCA1从溶酶体向质膜再分布，降低溶酶体胆固醇，增强胆固醇外排，减少细胞内胆固醇。
**2.6 LNP@A在体外恢复衰老BMSCs的成骨潜能**
LNP@A处理衰老BMSCs后，免疫印迹显示mTORC1活性（p-s6k、p-mTOR）降低，LC3II、PINK1、PARKIN升高，p62减少；免疫荧光证实mTOR-溶酶体共定位下降，自噬体和线粒体自噬增加，线粒体膜电位恢复。SA-β-gal染色、p21/p53免疫荧光和衰老相关分泌表型（SASP）因子检测表明LNP@A显著减轻细胞衰老。茜素红S（ARS）和碱性磷酸酶（ALP）染色显示LNP@A增强矿化结节形成；免疫荧光和免疫印迹证实成骨标志物RUNX2、OPN和OCN表达升高。
**2.7 LNP@A局部给药后表现良好生物安全性**
Cy5标记LNP@A局部注射至骨缺损部位后，活体荧光成像显示其在缺损区持续富集达36小时，随后主要通过肾脏清除，未在主要器官蓄积。血清ELISA检测显示LNP@A不触发系统性炎症反应；骨组织免疫荧光和免疫组化表明LNP@A显著抑制局部IL-1β和IL-6表达。
**2.8 LNP@A在体内增强老龄大鼠成骨潜能**
在老龄大鼠股骨髁缺损模型中，LNP@A局部注射2周后micro-CT显示骨体积/组织体积（BV/TV）、骨密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）增加，骨小梁分离度（Tb.Sp）降低；4周时缺损区几乎完全被新生骨填充，而老龄对照组未见明显修复。H&E和Masson三色染色进一步证实LNP@A组新生骨组织更规则致密，Lane-Sandhu评分显著提高。步态分析和后肢负重测试显示LNP@A促进功能恢复；力学测试证实新生骨质量和强度改善。骨组织免疫荧光和免疫组化显示LNP@A降低mTORC1活性，恢复自噬，减轻衰老，增强成骨；同时溶酶体胆固醇水平下降。
**总结与讨论**
本研究揭示了ABCA1介导的溶酶体胆固醇积累在衰老BMSCs自噬抑制中的角色，并阐明了ABCA1棕榈酰化循环如何影响其亚细胞分布。基于此机制，研究人员设计了细胞器靶向去棕榈酰化酶RA，并利用衰老靶向脂质纳米粒递送RA mRNA（LNP@A），将ABCA1的棕榈酰化循环向质膜倾斜，从而恢复自噬、逆转细胞衰老并增强成骨潜力。该策略在体外和体内均得到验证，为年龄相关骨缺损及其他涉及蛋白质棕榈酰化/去棕榈酰化循环的疾病提供了新型治疗思路。研究也指出若干局限性，如未直接追踪ABCA1动态转运、未明确去棕榈酰化与泛素化降解途径的交互、未鉴定衔接蛋白以及未全面评估RA对其他棕榈酰化蛋白的影响，需后续研究进一步阐明。
**研究结论（翻译原文）**
总体而言，本研究揭示了ABCA1介导的溶酶体胆固醇积累在衰老BMSCs自噬抑制中的作用，并探讨了ABCA1的棕榈酰化循环如何影响其亚细胞分布。基于这一机制，研究人员设计了细胞器靶向去棕榈酰化酶RA，并采用衰老靶向脂质纳米粒作为RA mRNA的递送载体。LNP@A在衰老BMSCs中驱动ABCA1的棕榈酰化循环朝向质膜。其在恢复自噬以逆转细胞衰老并最终增强成骨潜力方面的效力已在体外和体内得到验证。本研究为年龄相关骨缺损及其他涉及蛋白质棕榈酰化/去棕榈酰化循环的疾病干预提供了新的治疗见解。
