一种双相水凝胶通过激活EZH2-NeuroD1-SRCIN1神经元转化轴来预防胶质母细胞瘤的复发

《Biomaterials》：A Biphasic Hydrogel Prevents Glioblastoma Recurrence by Activating an EZH2-NeuroD1-SRCIN1 Neuronal Conversion Axis

　　

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）在切除后的复发仍然是脑癌治疗中的一个关键挑战。嗜神经转录因子NeuroD1具有将残留的GBM细胞重新编程为神经元的潜力，从而防止复发。然而，它也可能作为GBM的肿瘤启动和维持因素。在这里，我们定义了一个EZH2-NeuroD1-SRCIN1治疗轴。在这个轴中，抑制赖氨酸甲基转移酶EZH2可以减少组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），从而打开染色质，进而增强内源性和外源性传递的NeuroD1的表达和活性。这通过诱导与神经发生相关的蛋白SRCIN1，在体外启动GBM向神经元的转化，并抑制GBM细胞的增殖。为了维持长期的神经元重编程效率，我们开发了一种双相水凝胶（biHG），用于将EZH2抑制剂和外源性NeuroD1共同输送到小鼠同源和人类异种移植的GBM切除腔中。这种策略不仅显著阻碍了肿瘤复发，还成功地将残留的GBM细胞重新编程为具有部分功能的类神经元细胞，主要表现出VGLUT1阳性的谷氨酸能表型。因此，针对EZH2以使GBM细胞对NeuroD1-SRCIN1介导的神经元转化敏感代表了一种有前景的术后GBM复发治疗方法。

引言

胶质瘤是中枢神经系统（CNS）中最常见的恶性肿瘤，具有相当高的发病率和死亡率。1, 2, 3 根据当前的世界卫生组织（WHO）分类，胶质瘤可以分为四个组织学等级。⁴其中，IV级胶质瘤，也称为胶质母细胞瘤（GBM），具有最高的恶性程度，并占确认的胶质瘤病例的大多数。⁵GBM的年发病率因国家和地区而异，中国约为每10万人中有1-4例⁶，美国约为每10万人中有6例⁷。GBM的主要治疗方法是通过手术切除，随后进行辅助治疗，如放疗或化疗。尽管遵循“最大安全切除”原则的GBM手术旨在完全切除肿瘤并尽可能保留脑组织，但实际上GBM总是会复发。因此，这种类型的肿瘤预后较差，即5年生存率仅为6.8%，中位生存期仅为14.6个月。^{8, 9}这是由于GBM表现出扩散性生长模式，导致侵入深部脑区。¹⁰因此，手术无法切除所有浸润的肿瘤细胞。GBM的术后管理仍然是一个巨大的挑战，因为目前还没有建立有效的治疗复发性或进展性GBM的标准程序。⁹通常使用替莫唑胺（Temodar?）与放疗结合作为术后治疗。¹¹然而，替莫唑胺的半衰期短为1.8小时，脑部分布率低（17.8%），需要重复给药和高剂量方案，这限制了其疗效并增加了不良事件。¹¹此外，尽管提出了许多有前景的术后治疗策略，如免疫疗法¹²或使用病毒载体的基因疗法¹³，并且一些正在向临床转化迈进，但迄今为止尚未取得重大突破。

谱系特异性转录因子在胚胎发育过程中强烈影响细胞命运决策，可以诱导体细胞的表观遗传重写，并将它们转化为其他细胞类型，包括神经元。¹⁴嗜神经转录因子（TFs）如NeuroD1、Neurog2和Ascl1属于基本螺旋-环-螺旋（bHLH）家族的TFs，在脑发育早期阶段神经分化的诱导中起核心作用。^{15, 16}特别是NeuroD1，当通过病毒载体传递时，能够将星形胶质细胞和小胶质细胞等体细胞类型重新编程为神经元^{17, 18, 19}，因为这些胶质细胞和神经元来源于相同的神经前体细胞。²⁰这种神经元转化的效率似乎与NeuroD1的表达水平有关。²¹然而，通过NeuroD1过表达将胶质细胞重新编程为神经元仍然存在争议。这主要是由于体内转导效率低，以及慢病毒可能实际上靶向神经前体细胞而不是成熟胶质细胞。^{22, 23, 24, 25}尽管存在这些挑战，TF介导的重编程原理激发了一种针对GBM的新治疗策略：将残留的、切除后的肿瘤细胞转化为非增殖性的、有丝分裂后的神经元。这种方法具有双重好处：补充因肿瘤而丢失的神经元并防止肿瘤复发。临床前研究表明，直接将携带Neurog2、Ascl1或NeuroD1的病毒载体注入肿瘤组织内，可以有效诱导神经元转化并抑制胶质瘤细胞的增殖。^{26, 27, 28, 29, 30}这与观察到的胶质细胞的情况一致，即这些促神经TF的表达水平强烈影响胶质瘤向神经元的重编程效率。

组蛋白修饰在基因表达的表观遗传调控中起着关键作用。³¹具体来说，NEUROD1基因可以通过在组蛋白3第27位赖氨酸上沉积抑制性标记（H3K27me3）而被沉默。³²这种修饰由Polycomb抑制复合体2（PRC2）催化，其中zester同源物增强子2（EZH2）作为核心酶亚基。³³因此，EZH2抑制剂如UNC1999和GSK126能够上调髓母细胞瘤（MB）中的NeuroD1表达，从而促进神经分化和抑制肿瘤生长。³⁴由于MB和GBM都来源于神经前体细胞/神经干细胞³⁵，因此应用EZH2抑制剂也可能增强GBM细胞的NeuroD1诱导的神经元转化。体内，这种GBM向神经元的转化高度依赖于将EZH2抑制剂和外源性NeuroD1输送到GBM细胞中，因为血脑屏障（BBB）阻止了几乎100%的大分子神经治疗药物和超过98%的小分子药物进入大脑。³⁶局部应用的治疗药物负载水凝胶被认为是防止术后肿瘤复发的一种有前景的替代方案。³⁷此外，与一次性注射相比，从水凝胶基输送系统缓慢局部输注病毒载体可能会导致肿瘤病变中的转导率更高，而在周围健康组织中的转导率较低。³⁸然而，水凝胶通常仅限于输送亲水性药物，当负载疏水性药物时，剂量较低且释放迅速。^{39, 40}

在这项研究中，我们确定了SRC激酶信号抑制剂1（SRCIN1）介导的途径，作为在EZH2抑制后指导NeuroD1诱导的细胞命运朝向最终神经发生而非增殖的关键开关。基于这一机制，我们开发了一种油水共存的双相水凝胶（biHG），用于将携带NEUROD1基因和EZH2抑制剂UNC1999的慢病毒（U+N@biHG）共同输送到切除后的腔中。这种局部治疗在小鼠同源和人类异种移植的GBM切除模型中有效防止了肿瘤复发。值得注意的是，这种治疗效果伴随着切除肿瘤区域中心存在相当比例的GBM细胞衍生的功能性类神经元细胞，强烈表明GBM向神经元的转化得到了增强。

节段片段

在胶质瘤细胞中过表达Neurog2、NeuroD1或Ascl1可以减少细胞增殖，并在体外和体内促进胶质瘤细胞向神经元的分化。^{26, 27, 28, 29, 30}为了确定NEUROD1、NEUROG2或ASCL1表达水平与胶质瘤预后之间的潜在关联，我们利用癌症基因组图谱（TCGA）项目数据集分析了它们的表达水平与胶质瘤患者生存时间之间的关系。

讨论

GBM是最常见的成人脑恶性肿瘤，传统的手术切除无法完全清除肿瘤细胞，尤其是因为GBM的侵袭性特征导致肿瘤细胞渗透和扩散到邻近的健康组织中。因此，术后GBM复发非常普遍，大约80%的复发病例发生在局部，20%的病例发生在远处。⁶⁰不幸的是，化疗或放疗提供的效果有限

CRediT作者贡献声明

Hongbo Zhang:资金获取。Fulvio Reggiori:写作——审稿与编辑，资金获取。Feng Wan:形式分析。Qi Liu:资金获取。Xiaobing Jiang:写作——审稿与编辑，监督，概念化。Cuifeng Wang:写作——审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。Chaolu Han:方法学，研究。Qi Tang:方法学，研究，形式分析，写作——初稿。Ting Lai:写作——初稿，方法学，

作者声明没有竞争性财务利益。

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢Evident有限公司的应用工程师Xiaoxiao Jin和Yadong Zhu在使用研究幻灯片扫描仪VS200进行组织成像实验方面提供的支持。手稿中的图表是使用BioRender.com创建的。本工作得到了国家自然科学基金（82073772, 82260578）、广东省基础与应用基础研究基金（2026A1515012480, 2023A1515010613 和2021B1515140044）、科技规划项目

Yinqiu Tan|Qi Tang|Ting Lai|Yuntao Li|Chaolu Han|Baichen Liu|Libo Sun|Runkang Wang|Feng Lyu|Feng Wan|Qi Liu|Hongbo Zhang|Fulvio Reggiori|Xiaobing Jiang|Cuifeng Wang