10-catechyl-pyranocyanidins的颜色和稳定性受C3取代模式、咖啡酸辅色作用和抗坏血酸降解的影响

《International Journal of Food Properties》：Color and stability of 10-catechyl-pyranocyanidins as influenced by C3 substitution patterns, caffeic acid copigmentation, and ascorbic acid degradation

　　

本手稿的目的是评估四种10-catechyl-pyranocyanidins (PCys)与其前体花青素(anthocyanins, ACNs)相比的颜色和稳定性。研究人员探讨了糖基化和酰化模式、与咖啡酸(caffeic acid, CA)的辅色作用以及对抗坏血酸(ascorbic acid, AA)添加的稳定性。将pH调节至3的水用含有或不含CA的PCys或其前体ACNs着色。还比较了含有10-catechyl-pyranocyanidin-3-xylosylglucosylgalactoside (PCy-3-xylglugal-catechol)和cyanidin-3-xylosylglucosylgalactoside (Cy-3-xylglugal)的样品在添加和不添加AA时的稳定性。样品在25°C避光条件下孵育15周，监测颜色和色素稳定性。PCys在整个储存期间保持稳定（15周后保留80–90%），而ACNs降解（保留30–50%）。与CA的辅色作用导致PCy光谱发生红移(bathochromic shift)，降低了PCys与其前体ACNs之间的光谱和颜色差异（ΔΕ从10降至5）。PCys对AA介导降解的稳定性远远超过前体ACN，半衰期增加了70倍。

花青素（anthocyanins, ACNs）是一类多酚化合物，广泛存在于自然界的水果和蔬菜中，赋予其颜色。ACNs基食品色素因其潜在的健康益处（如抗炎、抗癌、缓解慢性疾病、控制肥胖等）在食品工业中逐渐替代石油基色素。然而，ACNs的稳定性远低于石油基色素，其颜色稳定性受食品基质（pH和组成）、食品成分以及加工和储存条件的影响，这限制了其作为食品色素的应用。吡喃花青素（pyranoanthocyanins, PACNs）是一类源自ACNs的色素，在葡萄酒等富含ACNs的食品中少量存在，由ACNs与具有烯醇化双键的化合物反应生成。PACNs在结构上保留其前体ACNs的糖基化和酰化模式，但额外增加了一个位于ACNs C4位和OH5位之间的吡喃环（该位点是ACNs降解反应的关键位点之一）。已有研究表明，PACNs具有与ACNs相当的物理化学特性（如摩尔吸光率、颜色、抗氧化活性等），且对亲核攻击（如亚硫酸盐漂白、抗坏血酸反应和pH变化）具有更高的稳定性。10-catechyl-pyranocyanidins（PCys）是羟基苯基-PACNs的一个亚类，由咖啡酸（caffeic acid, CA）与ACNs反应生成，产率可达约80%。然而，关于不同C₃取代模式的PCys在咖啡酸辅色作用和抗坏血酸降解条件下的稳定性，尚无系统研究。因此，本研究旨在系统比较不同C₃取代模式（糖基化和酰化模式）对10-catechyl-PCys分子颜色和稳定性的影响，并进一步评估咖啡酸辅色作用和抗坏血酸介导降解对PCys稳定性的影响，同时与其前体ACNs在pH 3条件下进行比较。研究人员假设，PCys的稳定性和颜色受与ACNs相同因素（糖基化/酰化模式、辅色作用、抗坏血酸添加）的影响，但降解程度远低于前体ACNs。本研究通过制备色素分离物、光谱分析、色度学计算和液相色谱-质谱联用（UHPLC-PDA-ESI-MS/MS）等技术，验证了PCys作为更稳定植物源食品色素的潜力。论文发表在《International Journal of Food Properties》。

为开展本研究，研究人员采用的关键技术方法包括：从黑莓（当地超市，Columbus, OH, USA）和黑胡萝卜色素基商业着色剂（DDW The Color House，Louisville, Kentucky, USA）中提取并半纯化花青素（ACNs）和10-catechyl-pyranocyanidins（PCys）；使用半制备型高效液相色谱（HPLC）系统分离色素，配合UHPLC-PDA-ESI-MS/MS进行色素鉴定；通过紫外-可见光谱（280–700 nm）和色度学软件（ColorBySpectra）计算CIE-L*c*h*颜色参数及色差（ΔE）；利用一级动力学模型计算色素半衰期，并采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计比较。所有色素纯度均高于92%。

研究结果如下：

**Initial spectra and colors of ACNs and PACNs at pH 3**：通过光谱分析发现，PCys在可见光区的吸收峰（λmax）位于500–505 nm，较其前体ACNs（λmax 511–513 nm）发生蓝移（hypsochromic shift），对应色相角（hue angle）约30°（橙红色），而ACNs色相角为5–10°（红色）。糖基化和酰化模式影响λmax和色相角，三糖基化PCys的λmax最高，单糖基化最低。

**Copigmentation effects of caffeic acid with PACNs at pH 3**：添加咖啡酸（CA）后，所有PCys样品的λmax发生红移7–8 nm，且部分样品（PCy-3-glu-catechol和PCy-3-couglu-catechol）出现增色效应（hyperchromic shift）。辅色作用使PCys的λmax接近典型ACNs（如Cy-3-glu的510 nm），缩小了光谱和颜色差异：PCys与ACNs的色差（ΔE）从约10降至约6。颜色数据表明，CA降低了样品的明度，提高了彩度，使色相角减小约10°，增强了红色调。

**ACN and PACN stability at 25°C in water at pH 3**：通过UHPLC-PDA-MS/MS监测相对浓度（RC）变化，15周后ACNs的RC降至33–46%（半衰期71–96天），而PCys的RC保持在78–95%以上，其中PCy-3-xylglugal-catechol和PCy-3-rut-catechol的RC>90%，半衰期超过700天。糖基化和酰化模式显著影响稳定性（p<0.001）：三糖基化PCys最稳定，其次为二糖基化，单糖基化（包括酰化）最差，且酰化增加了稳定性。

**Color stability of ACNs and PACNs at 25°C in water at pH 3**：色度学数据显示，ACNs的明度增加约5%，彩度下降约60%，色相角增大，总色差（ΔE）>10。PCys的明度变化<1%，彩度和色相角变化<6%，ΔE在0.8–2.9之间，表明颜色高度稳定。PCy-3-xylglugal-catechol的ΔE最小（0.8）。

**PACN stability and color in the presence of caffeic acid at pH 3**：0–11周内，含CA的PCys样品RC高于不含CA的样品，表明CA辅色作用提高了稳定性。但11–15周后差异缩小，可能因CA聚合或氧化导致辅色效果减弱。颜色稳定性方面，PCy-CA复合物样品最稳定，明度、彩度和色相角变化最小；其中PCy-3-glu-catechol样品在无CA时出现沉淀，导致彩度下降，而CA添加后未观察到沉淀，说明CA抑制了色素聚集。

**PACN stability and color in the presence of ascorbic acid at pH 3**：以PCy-3-xylglugal-catechol和Cy-3-xylglugal为模型，抗坏血酸（AA）使ACN在1天内RC降至47%，2天降至15%，半衰期<24小时，颜色严重褪色（明度接近100，彩度接近0）。而PCy在AA存在下的RC从100%降至47%需105天，半衰期>1848小时，是ACN的77倍，且颜色变化小（ΔE<3）。这表明PCys对AA介导降解的稳定性远优于ACNs，归因于吡喃环占据ACN的C4位，阻止了亲核攻击。

总结讨论部分：本研究表明，PCys在pH 3条件下具有优异的颜色和分子稳定性，受C₃取代模式（糖基化和酰化）影响显著，其中三糖基化和二糖基化PCys稳定性最高。咖啡酸辅色作用可缩小PCys与ACNs的光谱和颜色差异，并增强稳定性（尤其在初期）。抗坏血酸加速PCys降解，但半衰期仍比ACNs提高70倍。研究结论如下：PCys在pH 3、25°C避光储存15周后保留率超过80%（最高达95%），而前体ACNs保留率低于50%。四种PCys中，三糖基化PCy最稳定，其次为二糖基化、酰化单糖基化和非酰化单糖基化。咖啡酸辅色作用在0–11周内略微提高PCys保留率，并增强颜色稳定性。抗坏血酸虽加速PCys降解，但其半衰期较ACNs提高70倍，颜色变化小。研究结果验证了PACNs作为更稳定植物源食品色素替代石油基染料在酸性水溶性应用中的可能性。