综述：地中海贫血患者诊断与随访的遗传学方法：一项全面叙述性综述

《Thalassemia Reports》：Genetic Approach in Diagnosis and Follow-Up of Patients with Thalassemia: A Comprehensive Narrative Review

　　

地中海贫血是全球最常见的遗传性血红蛋白(Hemoglobin)疾病，全球每10,000名活产儿中约有4.4名受影响。准确的基因表征对于明确诊断和终身临床监测是必不可少的。在过去的二十年中，诊断模式经历了从传统的基于蛋白质的检测方法向全面分子技术的转变，包括下一代测序(Next-generation sequencing, NGS)和第三代（长读长）测序技术，这些技术反过来又促进了生殖医学领域的应用，例如针对单基因疾病的植入前遗传学检测(Preimplantation genetic testing for monogenic disease, PGT-M)，以便在植入前识别未受影响的胚胎。本综述旨在：(1) 系统性地评估用于确认α-和β-地中海贫血诊断的分子技术，包括其诊断准确性、适应症和局限性；(2) 探讨基因型与表型的相关性以及遗传修饰谱如何为临床预后和治疗决策提供信息；(3) 为接受输血、铁螯合治疗以及包括基因治疗在内的新型治愈性疗法的患者纵向随访，制定基于证据的遗传学监测参数。研究通过系统检索PubMed/MEDLINE数据库中2000年1月至2024年12月期间发表的英文同行评审文章，开展了一项全面叙述性综述。在应用预定义的纳入和排除标准后，最终纳入了43项研究。使用叙事性评论评估量表评估了纳入研究的方法学质量。高效液相色谱(High-performance liquid chromatography, HPLC)和毛细管电泳依然是一线表型分析工具；然而，基于脱氧核糖核酸(DNA)的确认检测对于完整的基因分型是强制性的。在已知的、先前已被表征的突变中，基于NGS的靶向基因面板实现了大于95%的检测灵敏度，但它们需要多重连接依赖性探针扩增(MLPA)联合检测或长读长测序来检测如大片段缺失等结构变异。通过分析三个主要修饰基因位点：XmnI (Gγ)、BCL11A和HBS1L-MYB，基因型-表型预测得到了实质性改善，尽管尚不能完全确定。使用NGS进行的PGT-M实现了近乎完全的基因分型准确性(>99%)，且每次冷冻胚胎移植周期的活产率达到40-60%。对于接受治愈性基因治疗的患者，目前建议制定跨越15年的分子随访方案。心脏T2*磁共振成像(MRI)仍然是用于铁过载随访的最可靠的非侵入性工具，优于单独的血清铁蛋白检测。一种分层的、结合基因型信息的综合方法——整合HPLC/CE表型分析、靶向分子诊断、遗传修饰谱分析以及定期重新评估——优化了诊断精确度，并指导了地中海贫血患者群体的个体化管理。将PGT-M和长读长测序整合入标准诊疗路径，加上健全的基因治疗随访方案，将定义地中海贫血遗传学管理的下一个时代。

1. 引言

地中海贫血包含一组异质性的遗传性血红蛋白疾病，其特征是一种或多种珠蛋白链合成减少或缺失，导致珠蛋白链产生失衡、无效造血、慢性溶血性贫血以及一系列系统性并发症。该疾病是全球最常见的单基因疾病。其分子基础极具多样性。α-地中海贫血主要源于影响16号染色体上HBA1和HBA2基因的缺失；而β-地中海贫血则主要源于11号染色体上HBB基因内超过400种已记录的点突变或小片段插入/缺失，导致β-珠蛋白链合成的部分(β⁺)或完全(β⁰)受损。临床谱从无症状的静止携带者、地中海贫血特征到输血依赖性地中海贫血主要型以及新生儿致死性的血红蛋白Bart`水肿胎综合征。中间型如地中海贫血中间型和血红蛋白H病则占据临床可变的中间地带。在大多数地中海贫血高负担国家，初步筛查从基础血液学开始。基于蛋白质的检测方法，特别是高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)，可对血红蛋白组分进行定量分析。尽管这些表型检测方法作为初步筛查工具不可或缺，但其具有局限性：无法区分突变亚型，且不足以进行遗传咨询。因此，必须进行基于DNA的检测以进行明确的分子确认。自20世纪90年代以来，基于DNA的分子诊断已从靶向限制性片段长度多态性(RFLP)分析和等位基因特异性PCR，发展到当今复杂的下一代测序(NGS)平台。

相同原发突变能产生显著不同的临床结果，这使得遗传修饰基因受到关注，特别是调控胎儿血红蛋白(HbF)表达的三大主要数量性状基因座(QTLs)：Gγ-珠蛋白基因启动子区的XmnI多态性、BCL11A内的单核苷酸多态性(SNPs)以及6号染色体上HBS1L-MYB基因间区域的变异体。这些位点的生物学机制虽不同但均汇聚于下游效应因子，即γ-珠蛋白基因的重新激活。XmnI-Gγ多态性在Gγ-珠蛋白基因上游产生GATA-1转录因子结合位点，增加启动子活性并使血红蛋白输出向更高的胎儿血红蛋白方向转移；在纯合状态下其效应最为显著。BCL11A编码一种锌指转录抑制因子，直接结合γ-珠蛋白基因启动子并招募NuRD染色质重塑复合物以在胎儿向成人血红蛋白转换期间沉默胎儿血红蛋白表达；BCL11A中的常见内含子SNPs会降低其表达，从而解除对γ-珠蛋白转录的抑制并提高HbF水平。HBS1L-MYB基因间区域包含调节MYB转录因子表达的调控元件；MYB剂量的减少会加速红系成熟并有利于胎儿血红蛋白合成的持续。由于这三个位点通过不同但趋同的机制发挥作用，累积的修饰基因评分能比任何单一位点提供更好的表型预测。基于普遍或靶向携带者筛查的预防计划及产前诊断已显著降低了重症地中海贫血的出生率。最近，针对单基因疾病的植入前遗传学检测(PGT-M)结合了体外受精(IVF)与基于NGS的胚胎基因分型，成为避免终止妊娠伦理负担的替代方案。2023年，基于CRISPR-Cas9的首个体外基因编辑疗法获批用于输血依赖性地中海贫血主要型(TDT)，这不仅引入了功能治愈的前景，也带来了治疗后监测这一全新的遗传学监管学科。

2. 目的

本研究具有四个主要目的。第一，系统评估用于确认α-和β-地中海贫血生化及血液学初步诊断的分子技术，涵盖常规PCR、HPLC、MLPA、Sanger测序、基于NGS的靶向基因面板、全外显子组与全基因组测序(WES/WGS)以及第三代长读长测序平台，并比较其诊断准确性、适应症及局限性。第二，探讨基因型-表型相关性和遗传修饰谱在预测疾病严重程度、区分输血依赖(TDT)与非输血依赖地中海贫血(NTDT)中的临床相关性。第三，为从无症状携带者到接受输血和铁螯合治疗的TDT患者，以及接受治愈性造血干细胞移植(HSCT)或基因治疗的患者，定义纵向随访的遗传学监测参数。第四，回顾β-地中海贫血的新型治愈性治疗方法。

3. 方法

3.1. 综述类型与PRISMA适用性
本研究构成了一项全面叙述性（非系统性）综述。由于本综述未进行正式的荟萃分析或遵循预先注册的方案，因此 Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses (PRISMA) 指南并非强制要求。然而，本综述采用了多项与系统综述相关的方法学要素，包括结构化的检索策略、预定义的纳入与排除标准以及正式的研究质量评估，以增强叙事性综合的严谨度和透明度。

3.2. 检索策略
在PubMed/MEDLINE数据库中检索了2000年1月1日至2024年12月31日期间发表的同行评审出版物，使用医学主题词和自由文本关键词组合进行检索。

3.3. 纳入与排除标准
研究纳入标准包括：以英文发表、涉及人类对象、涉及综述领域相关内容且提供足够的方法学细节以供质量评估的研究。排除标准包括少于5名患者的病例报告、无相关性的非地中海贫血血红蛋白病、未经同行评审的文献等。最终筛选出43篇文献进行详细综合。

3.4. 质量评估
采用特定领域的评估工具对纳入研究的方法学质量进行评估。使用QUADAS-2评估诊断准确性研究，使用Newcastle–Ottawa Scale (NOS)评估队列和观察性研究，使用AMSTAR-2评估系统综述，并使用叙事性评论评估量表评估叙事性综述。

3.5. 临床建议的证据分级系统
针对随访建议指定的证据等级遵循牛津循证医学中心(OCEBM)分级标准。Level I表示有一致的随机对照试验或指南共识证据支持；Level II表示有设计良好的队列研究或专家共识支持；Level III表示基于病例系列或专家意见。

3.6. 统计方法
由于本研究是非定量的叙述性综述，未应用正式的荟萃分析统计方法。在单项研究报告了诊断准确性指标时，这些指标被提取并描述性地呈现。

3.7. 生成式人工智能的使用
在完成证据综合后，使用了生成式人工智能协助进行语言润色及格式排版，未用于寻找文献或进行科学解释。所有AI辅助产生的输出均由作者进行批判性审查并批准。

4. 结果

4.1. 纳入研究概述
作为综述证据基础的43篇文献包括18篇原创研究、14篇系统综述、6篇指南或共识文件以及5篇大型注册中心或流行病学研究，发表年份介于2000至2024年间，覆盖了广泛的地理区域。

4.2. 分子与表型诊断技术
诊断手段从一线基于蛋白质的表型分析（HPLC、CE等）到前沿的第三代测序平台。HPLC和CE因其快速和可重复性依然是推荐的初步表型筛查工具。基于NGS的靶向基因面板与等位基因特异性PCR相比，提供了卓越的基因分型全面性。然而，没有任何单一技术是普遍充分的：大型结构异常需要MLPA联合检测，而复杂或罕见变异则需要第三代长读长测序。这些分子平台同样延伸至生殖领域，其中PGT-M和无创产前检测(NIPT)代表了生殖遗传学的前沿。正常与异常的α-和β-珠蛋白链结构的变化导致了珠蛋白合成失衡及无效造血。从胚胎期血红蛋白向胎儿血红蛋白及成人血红蛋白的发育转换动态对于理解遗传修饰基因及基因治疗的理论基础至关重要。

4.3. 基因型-表型相关性
基因型-表型关系比简单的孟德尔模型复杂得多。相同的原发β⁰/β⁰基因型根据共遗传的遗传修饰基因，可产生重度TDT或较轻的中间型表型。这解释了为何单一的基因分型不能完整预测临床严重程度，必须结合修饰基因分析。

4.4. 基于证据的遗传学随访参数
随访需求随疾病严重程度和治疗复杂性增加。当表型与基因型不一致时需进行周期性遗传学重新评估。每3-6个月通过HPLC进行HbF定量，可作为评估疾病严重程度的指标。每年进行的心脏和肝脏T2* MRI是监测铁过载的金标准，优于单纯血清铁蛋白检测。按照现行的监管指南，由于理论上的插入突变风险，基因治疗后的监测必须维持至少15年。

4.5. β-地中海贫血的基因治疗
两种互补的基因编辑策略已步入临床转化。第一种是直接纠正HBB突变或恢复β-珠蛋白产生；第二种是更具普适性的策略，即通过破坏BCL11A红系增强子重新激活HbF合成。exagamglogene autotemcel作为首个CRISPR-Cas9疗法已于2023年获批。除核酸酶编辑外，基因编辑工具包已扩展至碱基编辑器和引导编辑器。治疗后患者需要一条独立的密集分子监测路径，包括克隆追踪和插入位点分析等。针对诊断路径，本综述提取了从初始血液学筛查到基于HPLC的血红蛋白分析，再到分子诊断的逐步算法。对于随访，则分为针对携带者、症状性患者以及基因治疗后患者的三层监测路径。

5. 讨论

本研究证实了地中海贫血诊断的遗传学方法在过去25年中经历了变革式的演进。没有任何单一技术能覆盖所有突变谱。当临床怀疑罕见或复合基因型时，传统PCR不适宜作为独立工具。靶向NGS基因面板已成为首选的分子平台，其检测单核苷酸变异和小片段插入缺失的灵敏度超过95%。但对于大结构变异，尤其是染色体16上α-珠蛋白基因簇的复杂缺失和重复，短读长NGS分辨率不足，应辅以MLPA。第三代长读长测序技术实现了单次检测中的单倍型定相和结构变异表征，但其临床应用仍面临成本与生物信息学标准化的挑战。前沿技术在全球分布不均，在中低收入国家，更务实的策略是采用包含HPLC与针对常见群体突变的靶向PCR的分层诊断策略。基因型并不能完全预测临床严重程度，三个主要HbF调控QTLs的作用已被证实。携带者在这些位点上的单倍型保护作用显著。在流行病学方面，近亲结婚是患病风险升高的主要因素，提示需针对特定文化背景调整预防策略。随访监测方面，每3-6个月进行HbF定量兼具评估疾病严重程度与监测药效双重作用。每年进行MRI-T2*可及时优化铁螯合治疗并降低心脏铁过载死亡率。NGS基础的PGT-M基因分型准确率达99%以上，且避免了终止妊娠的伦理问题。基因编辑疗法的获批标志着管理模式的重大转变，但需长达15年包含克隆造血监测与HbA/HbF定量的分子随访。

6. 结论

地中海贫血诊断与随访的遗传学方法已演进为整合多平台分子技术的复杂学科。包含原发突变、α-基因剂量及HbF调控修饰位点的精确分子表征，对于预测临床严重程度至关重要。对于地中海贫血患者的症状管理，以序列HbF定量、年度心脏T2* MRI和表型不一致时的基因型重新评估为中心的长期遗传监测，为指导个体化治疗提供了综合框架。CRISPR-Cas9基因治疗的出现提出了长期分子监管的新要求。基因检测程序的标准化、全球分子诊断的公平可及性，将决定这些科学进展能否转化为全球数千万地中海贫血患者和携带者的实际预后改善。