冷等离子体辅助蛋白酶水解调控牛酪蛋白的抗原性、抗氧化特性和苦味

《Food Innovation and Advances》：Cold plasma-assisted protease hydrolysis modulates antigenicity, antioxidant properties, and bitterness of bovine casein

　　

酶水解已被证明是降低酪蛋白致敏性的有效方法；然而，其水解产物通常伴有强烈的苦味。因此，本研究采用两步法制备酪蛋白水解物，包括先进行碱性蛋白酶水解，随后进行冷等离子体（CP）处理。这种CP辅助酶处理实现了更高的水解效率，同时改善了酪蛋白水解物的适口性和功能特性。光谱和ELISA数据显示，与单独酶水解相比，CP辅助酶水解物表现出降低的内源性荧光强度、增强的表面疏水性，以及额外29.1%的IgE结合活性降低。此外，体外抗氧化测定表明，顺序处理有潜力提高酪蛋白水解物的抗氧化活性。同时，电子舌分析显示，与单独酶水解组相比，CP辅助酶水解物的苦味强度降低了11.3%。这些结果通过质谱和游离氨基酸分析进一步验证。总体而言，这种顺序处理可为开发具有降低残留抗原反应性和苦味的酪蛋白水解物提供有用的参考。

**论文解读：冷等离子体辅助蛋白酶水解调控牛酪蛋白的抗原性、抗氧化特性和苦味**

**研究背景与问题**

食物过敏是全球性的健康问题，其中牛奶蛋白过敏（CMA）在婴幼儿中尤为常见，超过77.5%的CMA反应由酪蛋白（CN）引发。因此，降低CN致敏性同时保持其营养价值是保障食品安全的关键。当前，酶水解是降低CN致敏性的常用方法，碱性蛋白酶因其高效性而被广泛使用，但水解产物常伴有强烈的苦味，且特定水解条件下可能残留抗原表位。冷等离子体（CP）是一种非热气体等离子体技术，可通过活性氧物种（ROS）等活性成分与蛋白质相互作用，实现结构修饰和肽键断裂。前期研究表明，CP单独处理可降低CN抗原性，但将其作为辅助手段同时调控水解物的抗原性和苦味的研究尚属空白。因此，研究人员旨在探索碱性蛋白酶水解后联合CP处理（顺序处理）对CN水解物结构、抗原性、抗氧化活性及苦味的影响，为开发低残留抗原性和低苦味的水解物提供实验依据。

**研究目的与意义**

本研究采用碱性蛋白酶水解后CP处理的顺序策略制备酪蛋白水解物（CNHs），系统评估其结构变化、抗原性降低效果、抗氧化能力及苦味改善情况。该研究为食品加工中利用非热技术优化蛋白水解物品质提供了新思路，论文发表在《Food Innovation and Advances》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用碱性蛋白酶水解（酶底比5000 U/g，45°C，pH 9.0，水解30、60、120 min）后，再利用介质阻挡放电（DBD）型CP发生器（75 W，10 min，氩气为载气）处理水解液。通过邻苯二甲醛（OPA）法测定水解度（DH），SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE分析分子量分布，间接ELISA检测IgE结合能力，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析二级结构，荧光光谱和表面疏水性（ANS探针）评估三级结构变化，粒度分析仪测定粒径和ζ电位，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定肽段并预测生物活性与苦味，DPPH、ABTS、铁离子螯合力和总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒评估抗氧化活性，氨基酸分析仪测定游离氨基酸（FAA）组成，电子舌量化苦味强度。人血清样本来自PlasmaLab International（美国），经宁波大学伦理委员会批准（NBU2025001）。

**研究结果**

**分子量分布与水解度**：DH测定显示，顺序处理组的DH显著高于单独酶水解组，ECN60-CP组DH比ECN60组高16.8%，与ECN120组相当。SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE表明，顺序处理使酶解产物中15 kDa和8 kDa的条带明显减弱或消失，说明CP促进了肽链的进一步降解。

**IgE结合能力**：间接ELISA结果显示，碱性蛋白酶水解使CN抗原性降低91.5%，而顺序处理（ECN120-CP）比单独酶解（ECN120）进一步降低29.1%的IgE结合活性，表明CP处理有助于破坏残留的抗原表位。

**构象变化**：FTIR分析显示，顺序处理改变了CN的二级结构，ECN60-CP与ECN60相比，β-转角含量增加5.7%，α-螺旋减少2.8%，提示局部解折叠和结构重排。紫外吸收光谱中，ECN120-CP的吸光度比ECN120高39.8%，表明肽键断裂和芳香族氨基酸暴露。荧光光谱显示，ECN120-CP的最大荧光强度比ECN120降低57.2%，表明色氨酸残基进一步暴露于极性环境。表面疏水性（H₀）测定中，ECN120-CP比ECN120高64.2%，说明顺序处理使更多疏水位点暴露。粒度分析表明，ECN60-CP的平均粒径比ECN60减小28.6%，ζ电位绝对值增加9.6%，表明CP处理破坏了非共价相互作用，提高了分散性和表面负电荷。

**质谱分析**：LC-MS/MS分析显示，顺序处理增加了0.5–1.2 kDa肽段比例，减少了2–3.5 kDa肽段，且肽段长度小于12个残基的比例增加（ECN120-CP比ECN120高6.3%）。表位覆盖分析表明，顺序处理使10个残留抗原表位中的部分彻底消失（如α_S1-CN的V101-L111、α_S2-CN的K180-Q187和K206-V215），其余表位强度显著降低，与ELISA结果一致。计算机预测显示，顺序处理降低了苦味肽的比例（BIT指标），ECN120-CP的苦味肽比例（BPF）比ECN120低6.9%。

**抗氧化活性**：DPPH自由基清除能力测定显示，ECN120-CP比ECN120提高1.9倍；ABTS自由基清除能力则降低17.1%，这可能与两种测试机制（氢原子转移 vs 电子转移）不同有关。铁离子螯合活性测试中，ECN120-CP达到阳性对照水平。总抗氧化能力（T-AOC）测定中，ECN120-CP比ECN120高约3倍。结果表明顺序处理整体改善了抗氧化相关特性。

**游离氨基酸组成**：FAA分析显示，顺序处理（ECN120-CP）的总游离氨基酸含量比ECN120低8.1%，但谷氨酸和天冬氨酸（负电荷氨基酸）含量增加18.9%，与ζ电位负向增加吻合。此外，8种苦味游离氨基酸总量在ECN120-CP中比ECN120低11.1%，提示CP氧化修饰可能降低了苦味氨基酸含量。

**电子舌分析**：电子舌苦味值测定显示，ECN60-CP的苦味强度比ECN60低11.3%，比ECN120低9.8%，表明顺序处理有效降低了水解物的苦味。

**总结讨论**

本研究系统论证了碱性蛋白酶水解后联合CP处理的顺序策略在制备CNHs中的优势。该策略整合了酶水解的选择性切割作用和CP的蛋白质氧化修饰功能，实现了更高的水解效率，同时降低了抗原性和苦味，并表现出抗氧化潜力。讨论部分指出，CP处理可能通过羟基自由基等活性物种进一步切割肽键、氧化氨基酸侧链，破坏非共价相互作用，从而重塑结构。然而，本研究也存在局限性：未进行详细的等离子体表征；IgE结合降低不能直接等同于临床安全性；缺乏定量氧化标志物分析可能导致抗氧化活性高估；加工条件、经济可行性和放大性仍需进一步研究。

**结论翻译**：本研究通过顺序碱性蛋白酶水解和CP处理水解CN，系统研究了水解物的结构特征、抗原性、抗氧化活性和苦味特性。这种顺序处理策略整合了酶水解的选择性切割作用与CP的蛋白质氧化修饰功能，从而提高了CN水解效率。由此，所得水解物表现出更高的水解度、更低的抗原性和苦味，同时展现出有前景的抗氧化潜力。然而，应承认若干局限性：未进行详细等离子体表征，限制了CP相关效应的解释；IgE结合降低不能保证临床安全性，需进一步评估；缺乏定量氧化标志物分析可能导致抗氧化活性被高估；加工条件、经济可行性和可放大性仍是未来研究的挑战。