《Food Materials Research》：Optimization of extraction conditions and characterization of phenolic compounds from cocoa bean shells using ordered ultrasound-microwave-aided extraction technique with different eco-friendly solvents
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研究人员通过Box–Behnken实验设计优化了可可豆壳（cocoa bean shells, CBS）中酚类化合物的可持续提取条件，随后评估了所得组分的自由基清除活性和对微生物的抑制潜力。在所评估的技术和溶剂系统中，使用乙酸钠、柠檬酸和水的混合溶剂（1:3:
研究人员通过Box–Behnken实验设计优化了可可豆壳（cocoa bean shells, CBS）中酚类化合物的可持续提取条件，随后评估了所得组分的自由基清除活性和对微生物的抑制潜力。在所评估的技术和溶剂系统中，使用乙酸钠、柠檬酸和水的混合溶剂（1:3:4，v/v/v）进行有序超声-微波辅助提取（ordered ultrasound-microwave-aided extraction, UME）获得了最高得率。在最佳条件下（溶剂加载量52.9 mL g?1，超声处理40.6分钟，温度51.8 °C，随后微波辐照16.8分钟），提取得率达到30.4%，酚类化合物含量为14.8 mg没食子酸当量（gallic acid equivalent, GAE）g?1干燥可可豆壳。所得组分还表现出强抗氧化和抗菌活性。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）鉴定了关键生物活性化合物，如咖啡酸、羟基苯甲酸、原儿茶酸和儿茶素。同时，气相色谱-串联质谱（GC–MS/MS）用于分析挥发性成分，包括2,2-二甲氧基丁烷、十一烷、环(L-脯氨酰-L-缬氨酸)、咖啡因和2H-环庚[b]呋喃-2-酮衍生物，以及6-(1-[乙酰氧基]-3-氧代丁基)-3,3a,4,7,8,8a-六氢-7-甲基-3-亚甲基。总体而言，该研究突显了绿色提取技术在获得可可豆壳酚类化合物方面的潜力，可用于功能性食品开发。
**论文解读：基于有序超声-微波辅助提取技术优化可可豆壳中酚类化合物的提取条件与表征**
**研究背景与问题**
可可豆壳（cocoa bean shells, CBS）是可可加工过程中产生的主要农业工业残留物，约占可可豆质量的10%–17%。传统上，CBS被视为低价值副产品，常被丢弃或用作动物饲料。然而，CBS富含蛋白质（约20.9%）、膳食纤维（约55.1%）以及多种生物活性化合物，尤其是甲基黄嘌呤（如可可碱）和多酚（如儿茶素和表儿茶素），这些化合物具有抗氧化和抗菌活性，使其在功能性食品开发中具有潜在应用价值。然而，传统溶剂提取方法存在提取时间长、温度高易导致生物活性化合物降解、有机溶剂毒性及环境风险等问题，限制了其在食品生产中的应用。因此，开发可持续、环保的绿色提取技术，并优化提取条件，对实现CBS的高值化利用具有重要意义。
**研究目的**
本研究旨在通过比较不同提取技术和溶剂系统，筛选出高效且环保的CBS酚类化合物提取方法，并利用Box–Behnken设计（Box–Behnken Design, BBD）优化提取条件，同时评估提取物的抗氧化和抗菌活性，以期为CBS在功能性食品中的应用提供科学依据。该研究发表于《Food Materials Research》。
**主要技术方法**
研究人员采用有序超声-微波辅助提取（ordered ultrasound-microwave-aided extraction, UME）技术，结合天然低共熔溶剂（natural deep eutectic solvents, NADES）系统（乙酸钠-柠檬酸-水，1:3:4，v/v/v），对可可豆壳（CBS）中的酚类化合物进行提取。样本来源为越南龙定公社Kimmy's Chocolate Ltd.提供的Theobroma cacao L.可可豆壳。通过Box–Behnken设计（BBD）优化溶剂加载量、超声时间、超声温度和微波时间四个变量。提取物得率（%）和总酚含量（total phenolic content, TPC）作为响应变量。采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）和气相色谱-串联质谱（GC–MS/MS）表征酚类化合物和挥发性成分，并通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性，通过纸片扩散法评估对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性。
**研究结果**
**1. 提取技术对CBS酚类回收的影响**
通过比较加热辅助提取（HE）、微波辅助提取（ME）、超声辅助提取（UE）、有序微波-超声辅助提取（MUE）和有序超声-微波辅助提取（UME），发现UME的得率（10.5%）和TPC（10.2 mg GAE g
?1）最高，分别比HE、ME和UE高出约5.1倍、1.7倍和2.5倍（得率）以及2.3倍、1.4倍和1.7倍（TPC）。说明先超声后微波的顺序能更有效地破坏细胞壁，增强溶剂渗透和传质，提高酚类化合物的释放效率。
**2. 溶剂系统对CBS酚类回收的影响**
在17种溶剂系统中，乙酸钠-柠檬酸-水（NaOAc–CA，1:3:4，v/v/v）系统表现最佳，得率26.8%，TPC 13.7 mg GAE g
?1。该系统通过形成天然低共熔溶剂（NADES），提供适宜的极性和酸性环境，增强酚类化合物的溶解度和氢键相互作用，从而提高提取效率。
**3. 优化条件**
Box–Behnken设计（BBD）模型拟合良好，决定系数（R
2）分别为0.933（得率）和0.948（TPC），失拟项不显著（p > 0.05）。优化条件为：溶剂加载量52.9 mL g
?1，超声时间40.6 min，超声温度51.8 °C，微波时间16.8 min，预测得率30.4%，TPC 14.8 mg GAE g
?1。验证实验得率31.7% ± 1.8%，TPC 14.7 ± 0.3 mg GAE g
?1，与预测值无显著差异（p > 0.05），表明模型可靠。
**4. 提取物的生物活性**
优化条件下的UME提取物（UME-S）的TPC（14.7 mg GAE g
?1）、总黄酮含量（TFC，9.90 mg RE g
?1）、DPPH（23.4 mg TE g
?1）和ABTS（31.7 mg TE g
?1）值均显著高于水相UME（UME-W）和HE。UME-S对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌圈直径（1.85 cm）显著大于阳性对照（1.28 cm），而对大肠杆菌（E. coli）无抑制作用。这种差异归因于革兰氏阳性菌缺乏外膜，酚类化合物更易穿透细胞膜。
**5. 化学表征**
UPLC–MS/MS鉴定出咖啡酸、羟基苯甲酸、原儿茶酸和儿茶素等主要酚类化合物，其含量在UME-S中最高。GC–MS/MS检测到2,2-二甲氧基丁烷、十一烷、环(L-脯氨酰-L-缬氨酸)、咖啡因等挥发性成分，可能对抗菌活性有协同作用。
**讨论与结论**
本研究成功开发了一种绿色、高效的提取方法，即有序超声-微波辅助提取结合乙酸钠-柠檬酸-水溶剂系统，用于从可可豆壳（CBS）中回收酚类化合物。优化后的提取物具有高总酚和总黄酮含量、强抗氧化能力以及对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的选择性抗菌活性。主要酚类化合物（咖啡酸、羟基苯甲酸、原儿茶酸、儿茶素）与这些生物活性密切相关。该方法为CBS等农业工业残留物的高值化利用提供了可行途径，所获得的富含酚类提取物可作为天然抗氧化剂和抗菌成分用于食品保鲜、货架期延长及保健品开发，并具有在食品、制药和化妆品行业的广泛应用潜力。虽为实验室规模，但为未来放大和工业应用奠定了基础。研究结论表明，通过优化提取条件，CBS中的酚类化合物可被有效回收，所得提取物具有显著的抗氧化和抗菌活性，支持其在功能性食品中的应用。
