新型初乳乳清衍生双功能蛋白-肽制剂（ProPepcw）的开发及其在腹泻治疗中的抗菌防御与免疫功能

《Food Bioscience》：Development of Novel Colostrum Whey-Derived Dual Function Protein-Peptide Formulation (ProPepcw) with Antimicrobial Defense and Immune Function in Diarrheal Therapy

　　

摘要

腹泻性疾病造成了巨大的全球健康负担，产肠毒素大肠杆菌 (ETEC) 每年导致 2.2 亿例腹泻发作，日益增长的抗生素耐药性需要紧急的非抗生素解决方案。我们开发了一种双功能初乳衍生物制剂，通过免疫刺激和直接抗菌作用对抗腹泻。萨希瓦尔初乳乳清经过超滤以分离出富含免疫蛋白的组分 (>50 kDa)，并通过利用鼠李糖乳杆菌对乳清进行蛋白酶解发酵，生成了抗菌肽组分 (<10 kDa)。通过 SDS-PAGE、RP-HPLC、LC-MS/MS 对组分进行了表征，并鉴定了 245 个肽序列。<10 kDa 组分显示出最高的抗菌效力，而>50 kDa 组分表现出卓越的免疫调节活性。筛选了九种蛋白与肽的比例，并制备了最佳制剂 (ProPep^cw)。ProPep^cw (4.34 mg:2.25 mg 蛋白：肽) 实现了最大的抗菌抑制作用，具有高细胞活力的吞噬指数，并在 4°C 下保持效力六个月。时间 - 杀菌动力学显示在 16–20 小时内完全杀菌消除 (≥3 log₁₀ CFU/mL 减少)。场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM) 和共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 证实了膜破坏、孔形成、胞质泄漏最终导致细胞裂解。总之，ProPep^cw 通过膜破坏实现增强的抗菌活性，同时刺激巨噬细胞介导的免疫，具有卓越的安全性，作为非抗生素治疗方案。

引言

腹泻性疾病仍然是全球健康的关键威胁，在发展中国家是导致发病率和死亡率的主要原因。世界卫生组织 (WHO) 估计，腹泻每年导致约 443,832 名五岁以下儿童死亡，并造成超过 17 亿例临床发作。它在 2016 年至 2020 年间五岁以下儿童死亡率中排名第三，约占每年死亡人数的 13% (印度国家家庭健康调查)。在六种致病型中，产肠毒素大肠杆菌 (ETEC) 具有特别强的致病性，每年造成约 2.2 亿例腹泻事件，其中包括五岁以下儿童约 7500 万例病例和 42,000 例年度死亡 (Anderson 等，2019 年；Khalil 等，2021 年)。目前腹泻的护理标准仍主要侧重于口服补液和营养支持的症状治疗，但这些方法无法加速黏膜愈合或缩短发作持续时间 (Barakat 等，2020 年)。重复的抗菌药物暴露加速了耐药性的出现，需要探索和发展安全的非抗生素替代品 (Rattanachaiwong 等，2022 年)。

牛初乳 (BC) 被称为“液体黄金”，因为它富含免疫球蛋白、生长激素、溶菌酶、乳铁蛋白和乳过氧化物酶等生物活性成分，有助于直接和间接的免疫反应。它还能通过刺激巨噬细胞和激活 B 细胞及 T 细胞来清除病原体，同时抑制病原体的结合 (Godden 等，2019 年；Ulfman 等，2018 年)。BC 的特征是高蛋白质含量 (20–150 g/L)，主要由免疫球蛋白 (IgG、IgA 和 IgM) 组成，占总蛋白的 70–80%，以及浓度为 6-8 g/L 的乳铁蛋白。

(McGrath 等，2016 年；Godden 等，2019 年；Niaz 等，2019 年)。牛初乳含有多种生物活性化合物 (Gomes 等，2021 年)，表现出与腹泻相关的抗菌、免疫调节和肠道营养特性。乳酸菌对乳清的蛋白酶解发酵会产生与完整亲本蛋白相比具有生物活性的低分子量肽。膜过滤技术是根据分子量分离和纯化肽类的最佳方法，无需化学添加剂，保留天然生物活性并浓缩目标分子。尽管关于单独初乳组分的文献丰富，但迄今为止，没有研究合理地将高分子量免疫蛋白与发酵衍生的抗菌肽结合，形成定义明确、剂量优化的制剂，用于同时管理腹泻和免疫调节。因此，本研究设计使用萨希瓦尔牛初乳，因为其广泛可得以及丰富的生物活性蛋白前体库，并通过超滤和蛋白酶解发酵对其进行分级。通过先进的质谱技术对所得组分进行表征。评估并验证了跨越蛋白：肽比例矩阵的抗菌、免疫调节、细胞毒性特征，以及用于临床前作为抗腹泻性 ETEC 的非抗生素治疗药物的双作用制剂 (ProPep^cw)。

章节摘要

菌株和化学试剂

鼠李糖乳杆菌 (NCBI 登录号：KF806538) 源自切达奶酪，FFFBAP 实验室库存，卡尔纳尔印度国家乳制品研究所 (ICAR)。马克斯克雅酵母 MTCC 1389 和腹泻指示菌株大肠杆菌 MTCC 723 购自印度昌迪加尔微生物菌种保藏中心 (MTCC)。所有试剂、化学品和培养基均为分析级，源自美国 Sigma-Aldrich 公司和印度孟买 Hi-Media 公司。本土

乳清组分的理化分析

萨希瓦尔初乳乳清的超滤和蛋白酶解发酵产生了四个不同的组分 (<50 kDa, >50 kDa, <10 kDa 和>10 kDa)，提供了关于组成特征的宝贵见解 (表 1 & S1)。初乳乳清中的蛋白质浓度 (3.43 ± 0.03 mg/mL) 降至发酵乳清中的 3.19 ± 0.01 mg/mL，表明 7% 的蛋白酶解。同时，肽含量增加了 2.9 倍，从 0.85 ± 0.01 mg/mL (初乳乳清) 增至 2.51 ± 0.01 mg/mL (发酵乳清)

结论

本研究开发了 ProPep^cw，一种发酵萨希瓦尔初乳乳清衍生物制剂，包含互补的>50 kDa 富含蛋白和<10 kDa 富含肽的组分，并展示了对产肠毒素大肠杆菌 MTCC 723 的免疫调节和抗菌潜力。结合制剂表现出增强的抗菌活性，证据来自 MIC、时间 - 杀菌动力学、SEM 和 CLSM 分析，表明膜破坏和细菌细胞损伤，而，富含蛋白

CRediT 作者贡献声明

SHILPA VIJ: 写作 – 审查与编辑，监督，资助获取，概念化。Diwas Pradhan: 写作 – 审查与编辑。Kiran Dhull: 方法学，调查。Pridwija P: 方法学，调查。Nishchal Thakur: 方法学，调查。Arundhati Ganesh Wandhare: 写作 – 原稿，方法学，调查

未引用参考文献

Nielsen 等，2024 年；Xu 等，2021 年。

伦理批准

动物实验是在方案 53/IAEC/24/14 下进行的，该方案经印度哈里亚纳邦卡尔纳尔印度国家乳制品研究所 (ICAR) 机构动物伦理委员会 (IAEC) 批准。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

数据可用性

如有合理请求，将提供数据

资助

这项工作得到了 卫生研究部 - 印度医学研究与理事会 (批准令号。R. 11020 /05/2024- GIA/HR) 外部资助的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢印度国家乳制品研究所，卡尔纳尔和畜牧业研究中心 (LRC) 提供初乳样品。

Arundhati Ganesh Wandhare|Nishchal Thakur|Pridwija P|Kiran Dhull|Diwas Pradhan|Shilpa Vij

印度哈里亚纳邦卡尔纳尔 -132001，印度国家乳制品研究所 (ICAR) 乳品微生物学系