整合植物化学分析及基于Keap1靶点的计算方法对Camellia longii花提取物中抗氧化化合物的研究

《Food Chemistry Advances》：Integrated phytochemical profiling and Keap1-targeted computational insights into antioxidant compounds from Camellia longii flower extracts

　　

本研究全面调查了Camellia longii花提取物的抗氧化活性、植物化学组成及潜在分子机制。在乙醇粗提物和四个分级提取物中，乙酸乙酯提取物表现出最高的总酚（774.30 ± 32.15 mg GAE/g DW）、总黄酮（278.72 ± 20.24 mg CAE/g DW）和总皂苷含量（65.62±0.87 mg OAE/g DW）。一致地，该提取物也显示出最强的抗氧化活性，其IC₅₀值分别为3.13 μg/mL（DPPH法）、6.10 μg/mL（ABTS法）和0.59 μg/mL（MDA法），以及EC₅₀为7.57 μg/mL（FRAP法）。此外，Pearson相关性分析揭示酚类和黄酮类含量与IC₅₀值之间存在强负相关关系（r = ?0.81至?0.91，p < 0.1），表明酚类化合物在抗氧化活性中的关键作用。UPLC–QTOF–MS/MS分析鉴定出90种化合物，其中40种属于黄酮类和酚类化合物。随后，研究人员利用机器学习和分子对接筛选潜在的Keap1–Nrf2抑制剂。有趣的是，预测有六种黄酮类化合物具有活性，与Keap1的关键残基（Arg380、Arg415、Arg483）具有强结合亲和力（?8.8至?10.0 kcal/mol）。这些发现表明双重抗氧化作用，包括直接自由基清除和潜在调节Keap1–Nrf2抗氧化通路。

**论文解读文章**

**研究背景与目的**
随着城市化和工业化进程加速，人类暴露于自由基和氧化应激的风险显著增加，导致活性氧（reactive oxygen species, ROS）和活性氮（reactive nitrogen species, RNS）过量生成，破坏内源性抗氧化防御系统，进而引发心血管疾病、神经退行性疾病及癌症等多种慢性病。植物来源的天然抗氧化剂因能清除自由基并调节氧化应激相关信号通路而备受关注。其中，Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）–核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）通路是细胞氧化还原稳态的核心调控枢纽。植物化学物，尤其是多酚和黄酮类化合物，可通过与Keap1相互作用增强Nrf2介导的抗氧化反应。山茶属（Camellia）植物富含儿茶素、黄酮类及酚酸类成分，具有显著抗氧化活性，但Camellia longii（红茶树）花的化学成分和抗氧化机制，尤其是与Keap1–Nrf2通路的关系，尚未系统研究。因此，研究人员开展了此项研究，旨在全面评估C. longii花提取物的植物化学组成、体外抗氧化活性，并结合机器学习（machine learning, ML）和分子对接（molecular docking）技术，探索其通过Keap1–Nrf2通路的潜在间接抗氧化机制。该论文发表在《Food Chemistry Advances》。

**主要关键技术方法**
研究人员从越南Bu Gia Map国家公园采集C. longii花朵，制备70%乙醇粗提物及正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水相四个分级提取物。采用UPLC–QTOF–MS/MS进行植物化学谱分析，鉴定化合物结构。通过DPPH、ABTS、FRAP和MDA四种方法测定抗氧化活性。利用Pearson相关性分析化学成分与活性之间的关系。基于ChEMBL数据库（靶标ID: CHEMBL3038498和CHEMBL2069156）的968个化合物构建ML模型，采用SMOTE处理数据不平衡，优化随机森林（Random Forest, RF）模型（Morgan2指纹+SMOTE）用于虚拟筛选。最后，使用AutoDock Vina对预测的活性化合物与Keap1蛋白（PDB ID: 2FLU）进行分子对接，分析结合模式。

**研究结果**

**3.1 提取物制备结果**
CLL-F-WE（水相）提取率最高（36.25%），但总酚（TPC）和总黄酮（TFC）较低；CLL-F-EAE（乙酸乙酯相）提取率为6.42%，但TPC和TFC最高。

**3.2 官能团定性结果**
植物化学筛查显示，CLL-F-EAE对多酚、黄酮、香豆素和鞣质呈强阳性；FT-IR光谱证实羟基（O–H）等官能团丰富，与UPLC-QTOF-MS/MS结果一致。

**3.3 定量植物化学物质（TPC、TFC、TSC）**
CLL-F-EAE的TPC为774.30 ± 32.15 mg GAE/g DW，TFC为278.72 ± 20.24 mg CAE/g DW，TSC为65.62 ± 0.87 mg OAE/g DW，均显著高于其他提取物，表明中等极性溶剂有利于多酚和黄酮的提取。

**3.4 抗氧化活性（DPPH、ABTS、FRAP、MDA法）**
CLL-F-EAE在四种抗氧化测定中均表现最强活性：DPPH的IC₅₀为3.13 μg/mL，ABTS的IC₅₀为6.10 μg/mL，FRAP的EC₅₀为7.57 μg/mL，MDA的IC₅₀为0.59 μg/mL（约为阳性对照BHT的9倍），表明其具有多机制抗氧化能力。

**3.5 化学成分与生物活性相关性分析**
Pearson相关性分析显示，TPC、TFC与FRAP的EC₅₀呈强负相关（r = ?0.91，p ≤ 0.05），与DPPH和ABTS的IC₅₀亦呈显著负相关（r = ?0.81至?0.91），证实多酚和黄酮是抗氧化活性的主要贡献者。

**3.6 UPLC-QTOF-MS/MS分析**
共鉴定出90种化合物，包括40种多酚类（24种黄酮、16种酚酸）、12种萜类、12种脂质等。CLL-F-EAE中鉴定出65种化合物，儿茶素及其衍生物（如儿茶素没食子酸酯）含量约5%，这些化合物已知能激活Keap1–Nrf2通路。

**3.7 机器学习模型与分子对接**
最优RF-Morgan2+SMOTE模型在测试集上达到准确率0.87、AUC-ROC 0.95。虚拟筛选从C. longii化合物中预测出6种活性化合物（编号3、87、37、76、2、82），均为黄酮类。分子对接显示，这些化合物与Keap1的Kelch结构域关键残基（Arg380、Arg415、Arg483）形成氢键和π-π相互作用，结合能范围为?8.8至?10.0 kcal/mol，其中3-cinnamoyltribuloside（76）结合能最高（?10.0 kcal/mol）。这些结果提示化合物可能通过竞争性抑制Keap1–Nrf2相互作用，从而激活Nrf2介导的抗氧化防御。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，体外抗氧化活性与化学组成相关性分析、机器学习预测及分子对接结果具有一致性，表明C. longii花中的多酚和黄酮类化合物不仅通过直接自由基清除发挥作用，还可能通过抑制Keap1–Nrf2蛋白-蛋白相互作用实现间接抗氧化。研究结论（翻译自原文“4. Conclusion”）如下：
对Camellia longii Orel & Luu花朵的研究揭示其富含多酚、黄酮及皂苷类植物化学物，通过双重机制——直接清除自由基和抑制Keap1从而间接激活Nrf2通路——表现出强抗氧化活性。体外结果、相关性分析、机器学习预测及分子对接模拟一致支持六种鉴定化合物能有效破坏Keap1–Nrf2相互作用，促进Nrf2介导的细胞抗氧化防御。该发现为C. longii在医药（尤其是抗氧化治疗）中的应用开辟了新潜力，同时为深入提取和测试该物种生物活性化合物提供了重要初始数据，进而有助于该物种在越南Bu Gia Map国家公园的保护、开发及利用，推动当地药用植物产品经济发展。