整合GC-HRAM-MS和UHPLC-QTOF-MS代谢组学揭示矿物诱导的戊糖乳杆菌9D3在牛奶发酵过程中的代谢适应

《Food Chemistry: X》：Integrated GC-HRAM-MS and UHPLC-QTOF-MS metabolomics reveal mineral-induced metabolic adaptation of Lactiplantibacillus pentosus 9D3 during Milk fermentation

　　

植物相关益生菌菌株在牛奶发酵中受到对乳制品基质适应不良的制约。研究人员通过基因组引导的微量营养素补充评估了改善戊糖乳杆菌9D3（Lactiplantibacillus pentosus 9D3）在牛奶中性能和代谢组学特征的方法。单独补充Mn²⁺或Mg²⁺显著增强了细菌生长和酸化，而Fe²⁺、Zn²⁺和B族维生素效果有限。最优补充方案为50 mg/L Mn²⁺和100 mg/L Mg²⁺，使活菌计数从7.54 log CFU/mL增加至8.89 log CFU/mL。尽管接种量从10%降低至6%，仍实现了约1.9 log CFU/mL的细胞群体增加。使用GC-HRAM-MS和UHPLC-QTOF-MS的整合代谢组学分析在补充发酵乳、非补充发酵乳和未发酵乳中鉴定出299种代谢物，并实现了组间分离。通路分析揭示了七个代谢通路（metabolic pathway）的显著富集，包括嘌呤（purine）、嘧啶（pyrimidine）、半乳糖（galactose）、丙酸（propanoate）、丁酸（butanoate）、氨基糖和核苷酸糖（amino sugar and nucleotide sugar）以及α-亚麻酸（α-linolenic acid）代谢。这些发现支持功能性乳制品的成本效益精准发酵。

**研究背景与问题**
植物源益生菌菌株在乳制品发酵中常因对乳基质适应不良而生长受限，尤其是戊糖乳杆菌9D3（*Lactiplantibacillus pentosus* 9D3）在牛乳中仅能实现0.5 log CFU/mL的活菌增加。为突破这一瓶颈，研究人员基于基因组注释和乳成分分析，提出通过靶向补充微量营养素来优化菌株发酵性能，并利用非靶向代谢组学揭示其代谢适应机制。该研究发表于《Food Chemistry: X》。

**研究内容与结论**
研究人员系统评估了B族维生素（B2、B3、B6、B7、B9、B12）和四种二价金属离子（Mn²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺）对L. pentosus 9D3在牛乳中生长和酸化的影响，发现Mn²⁺和Mg²⁺具有显著促进作用，而Fe²⁺、Zn²⁺及B族维生素效果有限，高浓度维生素B3甚至呈现抑制效应。通过优化组合（50 mg/L Mn²⁺ + 100 mg/L Mg²⁺）并降低接种量至6%（v/v），活菌数从7.54增至8.89 log CFU/mL，细胞净增约1.9 log CFU/mL。随后采用整合代谢组学分析，鉴定出299种代谢物，并发现补充组与非补充组及未发酵组间存在显著分离。通路富集分析揭示七个代谢通路显著改变，包括嘌呤、嘧啶、半乳糖、丙酸、丁酸、氨基糖和核苷酸糖以及α-亚麻酸代谢。

**关键技术方法**（不超过250字）
研究人员采用基因组引导的微量营养素分析（基于KEGG注释的3386个蛋白编码基因），结合浓度梯度实验筛选最优补充方案。样本来源：L. pentosus 9D3菌株来自泰国玛希隆大学营养研究所，牛乳为超高温灭菌（UHT）乳品（Mary Anne Dairy Products Co., Ltd.，泰国）。主要技术方法包括：非靶向代谢组学分析，即气相色谱-高分辨准确质量-质谱联用（GC-HRAM-MS）和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）两种互补平台；多变量统计分析，即主成分分析（PCA）、火山图（volcano plot）、热图（heatmap）及通路分析（MetaboAnalyst 6.0，*Homo sapiens*数据库）。

**研究结果**

**3.1 微量营养素补充对戊糖乳杆菌9D3在牛奶中生长的影响**
通过浓度梯度实验，研究人员发现单独补充Mn²⁺（10–50 mg/L）或Mg²⁺（10–100 mg/L）显著促进活菌计数和酸度下降，最优浓度下活菌数分别达8.63和8.42 log CFU/mL；而Fe²⁺、Zn²⁺及B族维生素（B2、B6、B7、B9、B12）效果微弱，B3在高浓度（10 mg/L）时抑制生长。

**3.2 接种量对矿物强化牛奶中戊糖乳杆菌9D3生长的影响**
在50 mg/L Mn²⁺和100 mg/L Mg²⁺联合补充下，研究人员将接种量从10%降低至6%（v/v）后，活菌数仍达8.72 log CFU/mL，净增1.87 log CFU/mL，且最终pH降至4.54，表明矿物强化可有效降低接种成本。

**3.3 全局代谢组学分析和多变量分析**
整合GC-HRAM-MS和UHPLC-QTOF-MS数据，共鉴定299种代谢物，分属15个超类（如有机酸、脂肪酸、甘油磷脂、碳水化合物等）。PCA图显示，未补充发酵乳（NSF）、矿物补充发酵乳（MSF）和未发酵乳（UFM）三组样本间代谢谱显著分离，组内重复性良好。

**3.4 发酵乳中差异代谢物分析**
火山图分析（fold change ≥2，FDR调整p<0.05）表明，与UFM相比，NSF和MSF分别有49和42个显著差异代谢物。热图显示前30个差异代谢物（包括氨基酸、脂肪酸酯、磷脂、核苷酸等）在组间呈现明显丰度变化，如乳糖衍生物在发酵后降低，而某些脂肪酸（如月桂酸衍生物）和神经酰胺在MSF中升高。

**3.5 代谢通路分析**
通路富集分析（–log₁₀(p) >2）显示，与UFM相比，NSF中富集了8个通路（包括丙酸、嘌呤、淀粉和蔗糖、氨基糖和核苷酸糖等），而MSF中富集了7个通路（包括嘌呤、丙酸、氨基糖和核苷酸糖、α-亚麻酸、丁酸、嘧啶和半乳糖代谢），表明矿物补充影响了核苷酸、碳水化合物和脂质代谢网络。

**讨论与结论**
讨论部分指出，L. pentosus 9D3在牛乳中生长受限是由于乳基质中微量营养素（尤其是Mn²⁺和Mg²⁺）不足，而基因组分析显示该菌株自身能合成部分B族维生素（如B1、B5），因此外源维生素补充效果有限。Mn²⁺和Mg²⁺的协同作用归因于Mn²⁺参与氧化应激保护和生物量合成，Mg²⁺作为ATP依赖反应和酶激活的辅因子。代谢组学变化揭示了矿物补充促进了氨基酸、脂质和核苷酸代谢的重塑，如嘌呤和嘧啶代谢增强反映活跃的细胞增殖，半乳糖和氨基糖代谢的富集与乳糖利用相关。研究结论翻译如下：靶向微量营养素补充，特别是Mn²⁺和Mg²⁺，有效改善了戊糖乳杆菌9D3在牛乳中的发酵性能，并伴随代谢组学谱的显著变化。非靶向代谢组学分析揭示了与氨基酸、碳水化合物、脂质和核苷酸代谢相关的代谢物和通路改变，表明微量营养素可用性显著影响了菌株在乳基质中的代谢活性。然而，Mn²⁺和Mg²⁺的具体生理角色未直接验证，应基于已知细菌功能作为合理机制解释。总体而言，这些发现为微量营养素增强的牛乳发酵提供了新的代谢组学见解，加深了对植物源乳酸菌在乳制品发酵中代谢适应的理解，并支持了戊糖乳杆菌9D3在成本效益精准发酵功能性乳制品中的潜在应用。未来需结合靶向代谢组学与生化分子验证来确认所鉴定代谢物和通路的生物学意义。