《Global Ecology and Conservation》：First molecular confirmation of
Zostera marina from the Romanian Black Sea coast based on ITS barcoding
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沿罗马尼亚黑海沿岸的海草栖息地稀少且破碎，物种级别鉴定的不确定性阻碍了有效的保护工作。本研究旨在利用结合野外观察、形态学、无人机(UAV)调查和内部转录间隔区(ITS) DNA条形码的整合方法，确认*Zostera marina*的出现。在康斯坦察北部的一个浅
沿罗马尼亚黑海沿岸的海草栖息地稀少且破碎，物种级别鉴定的不确定性阻碍了有效的保护工作。本研究旨在利用结合野外观察、形态学、无人机(UAV)调查和内部转录间隔区(ITS) DNA条形码的整合方法，确认*Zostera marina*的出现。在康斯坦察北部的一个浅海湾进行的调查中，记录到*Z. marina*作为以*Zannichellia palustris*为主的海草甸中的伴生物种。2025年7月的自由潜水直接观察到在1.6–2.4 m深度存在5个离散的*Z. marina*斑块，而2026年3月获取的全场无人机图像绘制了16个小且空间离散的斑块，总面积为41.36 ± 4.34 m2，记录了高度破碎的分布而非连续的草甸。形态学检查与已发表的*Z. marina*诊断特征一致，包括叶片形状、叶鞘配置以及圆形钝至略具短尖头的叶片先端。从7个枝条中获得的ITS序列与GenBank中的参考*Z. marina*序列具有高度相似性（≥99.26%）。系统发育分析将所有罗马尼亚样本置于一个支持良好的*Z. marina*进化支内，且与*Z. noltii*明显分离。这些结果提供了罗马尼亚黑海沿岸*Z. marina*的首次遗传学确认，并为该地区未来的监测、保护评估以及破碎海草栖息地分布和连通性的研究建立了基线。鉴于其极小的范围和破碎的结构，该种群值得预防性保护并应纳入区域海草监测。
海草甸作为分布最广且具有重要生态意义的沿海海洋生物群落之一，不仅是浅海生物多样性的热点区域，也是初级生产力的主要贡献者。它们提供关键的生态系统服务，包括长期碳封存（即“蓝碳”）、沉积物稳定化和海岸线保护、营养循环与颗粒物截留以改善水质，以及为具有重要商业价值的渔业提供栖息地和育苗功能。海草甸还能通过衰减波浪能量和促进沉积物堆积，增强海岸对气候变暖背景下海平面上升和风暴加剧的抵御能力。然而，尽管海草生态系统具有生态和社会经济重要性，但在全球和区域尺度上对其监测仍不均衡。特别是在系统发育关系、生物地理模式、种内遗传多样性以及形态可塑或隐存类群的分类界定方面仍存在关键的知识空白。这些空白在半封闭和边缘海域尤为明显，环境限制和强烈的人为压力会加速栖息地退化并使物种鉴定复杂化。
黑海作为一个半封闭盆地，具有永久分层、与地中海海水交换受限以及温跃层以下深水缺氧等特征。20世纪后期的退化主要由严重富营养化驱动，由于多瑙河等主要河流营养盐输入增加，在20世纪70至80年代达到顶峰，导致浮游植物周期性暴发、季节性沿岸缺氧以及底栖群落结构重组。尽管自2000年以来营养盐负荷减少使得水质和动物群落得到部分恢复，但黑海仍易受周期性富营养化、变暖、风暴规律改变、栖息地丧失、底拖网影响和生物入侵的影响。
在此背景下，黑海的海草甸稀少且破碎，而罗马尼亚海岸的覆盖率甚至更低。黑海本底盆地报道了两种海草：*Zostera marina*（通常分布至约15 m水深）和*Z. noltii*（主要分布在极浅水域）。历史上罗马尼亚水域关于海草的记录可追溯到一个多世纪以前，但早期报告主要依赖形态学，且缺乏凭证标本以供重新检验或测序。由于*Zostera marina*和*Z. noltii*之间的形态学重叠以及在富营养化条件下的显著表型可塑性，仅凭形态标准不足以可靠地区分这两个同属物种，且历史记录可能反映的是属内不确定的归类。因此，分子确认是在该地区建立可靠物种身份、分布和保护状态的先决条件。为了填补这一知识空白，研究人员结合形态学鉴定和内部转录间隔区(ITS)条形码技术开展了研究，首次在罗马尼亚黑海沿岸提供了该物种的遗传学确认。这一研究对于未来的监测、保护评估和区域海草动态研究具有重要意义，论文发表在《Global Ecology and Conservation》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：样本队列来源于罗马尼亚康斯坦察北部浅海湾采集的7个*Zostera marina*成熟枝条。研究结合了自由潜水野外观察、形态学分类鉴定、无人机(UAV)航空成像测绘评估斑块分布，以及基于核糖体DNA内部转录间隔区(ITS)的DNA条形码技术。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增和双向Sanger测序获取序列，利用最大似然法(ML)进行系统发育重建，并采用Kimura双参数模型计算种内和种间遗传距离以评估DNA条形码间隙。
3.1. 研究地点的野外调查与*Zostera marina*形态学鉴定
通过自由潜水调查，研究人员在1.6–2.4 m深度记录到5个离散的*Z. marina*斑块，叶片长度在90至180 cm之间，最长叶片出现在最浅水区域的最健壮斑块中，超过了局部水深并延伸至水面。无人机图像绘制了16个小且空间离散的斑块，总面积为41.36 ± 4.34 m
2，表明其呈高度破碎的分布而非连续草甸。形态学检查表明，其特征与已发表的*Z. marina*诊断特征一致，包括叶片形状、闭合的叶鞘配置以及圆形钝至略具短尖头的叶片先端，这些特征有效区分了*Z. marina*与*Z. noltii*，支持将采样枝条归类为*Z. marina*。
3.2. 基于ITS的分子分析
通过ITS DNA条形码分析，研究结果显示所有获得的序列与GenBank中的参考*Z. marina*序列具有高度相似性（≥99.26%）。系统发育分析将所有罗马尼亚样本置于一个支持良好的*Z. marina*进化支内，与*Z. noltii*明显分离并获得最大支持。种间和种内遗传距离计算表明，*Z. marina*和*Z. noltii*的种内差异分别为0-1.5%和0.3-0.4%，而两者间的种间差异显著较高（19.9-22.1%）。这种强烈的种内与种间距离分离表明存在明显的DNA条形码间隙。统计分析进一步支持了ITS在物种级别具有强大的鉴别能力，排除了与*Z. noltii*混淆的可能性。
在讨论部分，研究人员指出，尽管ITS在物种界定方面很有用，但在*Z. marina*进化支内的系统发育解析度有限，这表明评估精细的种群结构可能需要如微卫星或全基因组单核苷酸多态性等更高分辨率的标记。此外，该研究地点受2015至2016年海岸防护工程的保护，这些工程包括潜堤、加固堤防和富含贝壳的沙土补给，在向陆侧形成了低能量微生境，衰减了波浪能量和近床水动力压力，稳定了沙泥基底。这可能是该受光线限制且对干扰敏感的物种以小型斑块持续存在的合理机制。然而，残余持续存在与近期重新定殖两种情景目前无法确切区分，需要重复调查以评估斑块随时间的生长、合并或衰退。
关于研究结论，通过整合形态学检查与ITS DNA条形码分析，本研究提供了罗马尼亚黑海沿岸*Zostera marina*的首次遗传学确认。这一结果为重新评估*Z. marina*在罗马尼亚红皮书中的数据缺乏(DD)状态提供了证据基础，并支持区域生物多样性评估、世界自然保护联盟(IUCN)评估和蓝碳清单。鉴于其极小的范围和破碎的结构，该种群值得预防性空间保护，例如避免在草甸范围内抛锚和底栖干扰活动，并应正式纳入国家海草监测计划。未来需结合ITS与其他质体标记及更高分辨率的基因组学方法（如单核苷酸多态性），以阐明黑海区域*Z. marina*种群的遗传多样性、连通性和系统发育地理结构。在快速变化的黑海环境中，提升罗马尼亚海草的分类解析度和遗传学知识对于保护剩余栖息地及其提供的生态系统服务至关重要。
