Probio-M9和基因衰老清除通过靶向炎症相关细胞衰老减轻实验性结肠炎

《Engineering》：Probio-M9 and Genetic Senolysis Attenuate Experimental Colitis by Targeting Inflammation-Associated Cellular Senescence

　　

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，以慢性肠道炎症和有限的治疗选择为特征。细胞衰老通过衰老相关分泌表型（SASP）促进持续性炎症，提示调节衰老可能代表一种新的治疗策略。在这里，研究人员研究了益生菌Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9（Probio-M9）治疗和基因衰老清除对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎的治疗效果，使用p16^Ink4a-CreERT2-tdTomato（PT）小鼠追踪衰老细胞，以及p16^Ink4a-CreERT2-DTR-tdTomato（PD）小鼠在白喉毒素（DT）处理后选择性清除p16+细胞。对于宏基因组分析，评估粪便DNA以评估微生物多样性、分类组成和功能通路。在PT小鼠中，DSS诱导结肠缩短、脾肿大、黏膜炎症和信号转导及转录激活因子3（STAT3）激活，并在α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、分化簇31（CD31）、血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）和c-Kit阳性区室中积累tdTomato+衰老细胞。Probio-M9减轻了这些变化，减少了衰老细胞负荷，并抑制了SASP相关炎症，而不改变p21或p53表达。宏基因组分析显示Probio-M9重塑了微生物组成和代谢途径，包括选择性富集有益分类群。在PD小鼠中，DT介导的衰老清除降低了SASP表达、STAT3磷酸化和p21水平，同时增加了p53和腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化。DT干预显著改变了细菌间相互作用网络。益生菌干预和基因衰老清除均通过减少p16+衰老细胞的积累减轻了DSS诱导的结肠炎。此外，对人类IBD标本和独立公共转录组数据集的分析显示，在发炎组织中衰老相关特征增加，并在髓系免疫细胞中富集衰老特征，支持了本研究发现的临床相关性。总之，这些结果确定了炎症相关细胞衰老是IBD的治疗靶点，并提示Probio-M9通过调节微生物群-代谢-衰老轴减轻肠道炎症。

**论文解读：炎症相关细胞衰老作为IBD治疗靶点及Probio-M9的调节作用**

**研究背景与问题**

炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是一种慢性复发性炎症性疾病，尽管生物疗法取得进展，但许多患者仍面临持续性黏膜炎症、上皮修复缺陷和不可预测的发作，表明现有治疗方案存在局限。细胞衰老——一种由p16/p21通路介导的应激诱导增殖停滞，并伴随衰老相关分泌表型（SASP）——是慢性炎症的关键驱动因素。SASP相关细胞因子放大免疫激活、损害上皮稳态并促进基质功能障碍。肠道微生物群失调是IBD的另一标志性特征，且与衰老之间存在双向关系：失调菌群可促进细胞衰老，而衰老细胞可重塑黏膜微环境并加剧微生物失衡。然而，菌群失调是否驱动衰老细胞积累，或衰老细胞是否主动塑造IBD中的微生物群落，仍需进一步研究。益生菌已被报道可增强上皮屏障功能、调节黏膜免疫、增加短链脂肪酸（SCFA）相关代谢活性，并抑制STAT3和核因子-κB（NF-κB）信号。Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9（Probio-M9）分离自初乳，可重塑肠道菌群并减少结肠炎相关肿瘤发生，抑制乳腺肿瘤进展，延长秀丽隐杆线虫寿命，并通过调节微生物群落改善压力成人的生活质量。然而，Probio-M9在肠道炎症中对微生物群-衰老轴的潜在影响尚未被探索。近期衰老模型研究揭示了p16^high细胞的关键功能：Omori等[23]发现p16^Ink4a-CreERT2-tdTomato（PT）小鼠出现年龄相关p16^high细胞积累并促进代谢炎症；Reyes等[24]确定p16^Ink4a+成纤维细胞为炎症响应哨兵，支持上皮修复；Zhao等[25]证明p16+细胞类型在组织损伤和再生中具有不同作用。这些研究确立了PT小鼠作为可靠的衰老报告系统，以及p16-CreERT2-DTR系统作为研究因果性衰老清除的工具。因此，本研究旨在通过双管齐下的方法确定衰老p16+细胞群在肠道炎症中的分布和功能贡献：益生菌Probio-M9的药理学干预以评估衰老调节治疗潜力，以及通过p16^Ink4a-CreERT2-DTR-tdTomato（PD）小鼠中白喉毒素（DT）介导的p16+细胞遗传清除，直接建立其因果作用。通过整合这些衰老报告和衰老清除小鼠模型与微生物群-代谢物谱分析，并通过人类IBD组织验证，研究人员阐明了细胞衰老、微生物失调和黏膜炎症之间的因果关系，填补了IBD发病机制中的一个关键机制空白，并确定Probio-M9为潜在的衰老靶向治疗剂。

**关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：①使用PT（p16^Ink4a-CreERT2-tdTomato）和PD（p16^Ink4a-CreERT2-DTR-tdTomato）转基因小鼠模型，分别用于追踪衰老细胞和选择性清除p16+细胞；②通过口服给予2%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导实验性结肠炎；③对PT小鼠口服Probio-M9（1×10⁹ CFU/d），对PD小鼠腹腔注射DT（50 μg/kg）每三天一次以清除衰老细胞；④利用免疫荧光（IF）染色、蛋白质印迹（Western blot）和定量PCR（qPCR）分析组织病理、衰老标志物、炎症因子及SASP成分；⑤采用宏基因组测序（MGISEQ-2000平台）及生物信息学工具（HUMAnN3.0、MetaPhlAn3、MetaCyc数据库）分析粪便微生物多样性、分类组成、代谢通路及物种间互作网络；⑥对人类IBD肠道标本（来自福冈大学医院和香川大学医院）及五个公共转录组数据集（GSE166925、GSE66207、GSE214695、GSE16879、GSE73661）进行单样本基因集富集分析（ssGSEA）、AUCell评分等，验证衰老特征与疾病活动度的关联。

**研究结果**

**3.1 Probio-M9减轻了DSS诱导的结肠炎症和衰老细胞积累（PT小鼠）**
通过体重变化、结肠长度、脾脏重量、组织学评分及免疫荧光分析，研究人员发现DSS处理导致PT小鼠结肠缩短、脾肿大、黏膜炎症及STAT3激活，并在CD31+内皮细胞、α-SMA+平滑肌细胞、PDGFRα+成纤维细胞和c-Kit+间质细胞中积累tdTomato+衰老细胞。口服Probio-M9显著改善了这些参数，减少了衰老细胞负担，抑制了SASP相关炎症（如MCP1和IP-10表达下降），同时恢复了上皮再生能力（PCNA+细胞增加），但未改变p21或p53表达。

**3.2 Probio-M9干预调节了肠道微生物群的多样性和组成**
基于Chao1丰富度和Shannon-Wiener指数的α多样性分析显示，49天干预后，DSS+M9组的Shannon-Wiener指数显著低于DSS组和对照组，且主坐标分析（PCoA）表明三组间β多样性显著分离。物种水平分析发现24个物种丰度在组间有显著差异，Probio-M9选择性降低了一些潜在有害菌（如Adlercreutzia muris、Muribaculaceae bacterium）的丰度，并重塑了整体微生物组成。

**3.3 Probio-M9干预调节了肠道代谢通路和物种共现网络**
通过MetaCyc数据库代谢重建，研究人员发现DSS组中CDP-二酰甘油生物合成和5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成通路显著下调，而Probio-M9干预后，L-色氨酸超通路、6-羟甲基二氢蝶呤二磷酸和蔗糖生物合成通路显著上调，同时L-精氨酸生物合成、磷脂生物合成超通路和嘌呤核糖核苷降解通路呈现相反趋势。物种相关性网络分析表明，Probio-M9干预后DSS+M9组中物种间显著相关性数目（102个）高于DSS组（52个），说明Probio-M9增强了肠道微生物间的紧密联系。

**3.4 衰老细胞清除减轻了DSS诱导的结肠炎并抑制炎症和衰老信号（PD小鼠）**
在PD小鼠中，DT介导的衰老细胞清除显著降低了疾病活动指数（DAI），减轻了体重下降和脾肿大，但总组织学评分无显著变化。DT处理后，促炎细胞因子IL-17A、TGF-β表达下降，STAT3磷酸化受抑制，免疫荧光证实tdTomato+衰老细胞及其与CD31、α-SMA、PDGFRα、c-Kit共定位的细胞显著减少。蛋白质印迹显示p16和p21表达下降，p53表达上升，AMPK磷酸化恢复。DT还增加了上皮再生能力，减少了F4/80+巨噬细胞浸润和SASP因子（MCP1、IP-10）产生。

**3.5 DT干预显著降低了肠道微生物群的多样性和物种组成**
与DSS组相比，三周DT干预后DSS+DT组的Shannon-Wiener指数和Chao1丰富度显著降低，PCoA显示两组间β多样性显著分离。物种水平上，Bacteroidales bacterium、Olsenella_SGB42251、Prevotella_sp_MGM1丰度下降，而Heminiphilus faecis丰度上升，表明DT干预改变了微生物组成。

**3.6 DT干预显著调节了肠道代谢通路并减少了物种共现网络**
DT干预显著降低了甲基赤藓醇磷酸和L-组氨酸生物合成通路的丰度，并减少了共享代谢通路数目。物种相关性网络分析显示，三周干预后，DSS组和DSS+DT组中显著相关性数目分别从基线的178和173降至51和49，表明DT改变了细菌间互作网络关系。

**3.7 人类IBD数据集中衰老相关特征的验证**
通过分析五个公共转录组数据集，研究人员发现SenMayo衰老评分在正常结肠组织、非炎症IBD组织至炎症IBD组织中逐步升高，且CDKN2A（p16）表达在炎症组织中显著增加，而CDKN1A（p21）、TP53、LMNB1和MKI67基本不变。基线衰老评分可预测英夫利西单抗治疗反应（AUC=0.860），且成功治疗后评分下降。在独立队列中，衰老评分与Mayo内镜评分呈正相关。单细胞RNA-seq分析显示衰老相关特征主要在髓系免疫细胞中富集，支持免疫细胞衰老是人类IBD的特征。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，本研究证明细胞衰老是DSS诱导结肠炎中肠道炎症的关键贡献者。Probio-M9治疗和基因衰老清除均显著减少p16+衰老细胞积累、炎症细胞因子表达、巨噬细胞浸润和上皮损伤，从而改善结肠炎严重程度。Probio-M9通过调节微生物群-代谢-衰老轴而非直接作为衰老清除剂发挥作用，因为它不改变p21和p53，而是通过抑制炎症和代谢应激减少新衰老细胞产生。PD小鼠中p16+细胞的选择性清除确认了衰老细胞的因果驱动作用，且DT介导的衰老清除恢复了AMPK磷酸化和上皮再生。人类IBD标本和公共数据集分析进一步验证了衰老特征与疾病活动度和治疗抵抗的正相关，且髓系免疫细胞是主要衰老细胞群体。研究局限性包括：代谢通路变化未通过直接代谢组学验证；未研究衰老细胞在纤维化和肿瘤发生中的作用；研究仅用雌性小鼠；需进一步鉴定受微生物信号直接调控的特定细胞类型。结论部分翻译如下：总之，本研究发现炎症相关细胞衰老是IBD的治疗靶点，并提示Probio-M9通过调节微生物群-代谢-衰老轴可能提供一种安全有效的策略来抑制慢性肠道炎症。