配体偶联上转换纳米颗粒从外周神经系统到中枢神经系统的跨神经元转运

《JACS Au》：Transneuronal Transport of Ligand-Conjugated Upconversion Nanoparticles from the Peripheral to the Central Nervous System

　　

尽管神经纳米技术领域已取得显著进展，但纳米材料在周围神经元与中枢神经元之间移动以实现 cargo 递送、成像与追踪等应用，仍是一项艰巨挑战。这一局限凸显了开发能够促进高效轴内运输与突触间转位的工程化材料的迫切必要性。本研究报道了核-壳-壳结构上转换纳米颗粒（core–shell–shell upconversion nanoparticles, CSS-UCNPs）的设计与合成，该颗粒以 NaYF4:YbEr 为核，依次包覆活性 NaYF4:YbNd 壳层与惰性 NaYF4 壳层。为实现神经元特异性靶向，该结构经聚乙二醇（poly(ethylene glycol), PEG）-马来酰亚胺表面功能化，并偶联 RVG29 肽（CSS-PEG-RVG29）。透射电子显微镜、动态光散射与光谱分析表征确认了均匀的粒径（半径 42.9 nm）与高效的上转换发光（λex = 808 nm，λem = 500?575 nm）。体外实验显示，在浓度高达 500 μg/mL 时，该材料对 Neuro2a、NSC34 与 C6 细胞系具有低细胞毒性，RVG29 介导的细胞摄取增强，且经膜片钳电生理学评估，对脊髓神经元动作电位发放无可检测改变。体内实验中，小鼠坐骨神经束内注射（2 mg/mL，2 μL）导致纳米颗粒转运至脊髓背侧，并定位于中枢神经系统（central nervous system, CNS）更高位区与皮质，经多光子显微镜可视化。相比之下，使用乱序 RVG29 偶联纳米颗粒的对照实验显示 CNS 内积累可忽略。这些发现确立 CSS-PEG-RVG29 作为外周到 CNS 的 cargo 递送候选平台，具有广泛潜在应用。

研究背景与立项依据

神经纳米技术虽快速发展，但纳米材料在周围神经元与中枢神经元之间的高效移动仍是难题，限制了其在 cargo 递送、成像与神经环路追踪中的应用。某些嗜神经病毒（如狂犬病病毒）可借逆向轴突运输与跨突触传递绕过血脑屏障进入 CNS，这启示研究人员通过仿生策略设计材料以模拟病毒入胞机制。RVG29 肽源自狂犬病病毒糖蛋白，可高亲和结合神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs）与 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）受体，触发网格蛋白介导的内吞及 dynein 驱动的逆向运输。上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles, UCNPs）具备 808 nm 近红外激发、可见发射、深组织低背景优势。本研究在《JACS Au》报道一类 CSS-UCNPs 经 PEG-马来酰亚胺偶联 RVG29（CSS-PEG-RVG29），系统评估其从小鼠坐骨神经到脊髓及脑区的逆向运输与跨突触转位能力。

主要关键技术方法

研究人员采用高温热分解合成 NaYF₄:YbEr@NaYF₄:YbNd@NaYF₄ 核-壳-壳结构，经 DSPE-PEG/DSPE-PEG-Mal 包覆后以硫醇-马来酰亚胺化学偶联 RVG29 或乱序肽（scrRVG29）。体外以 Neuro2a、NSC34、C6 细胞系及原代脊髓/皮质神经元（取自胎鼠或新生鼠 CNS 组织）评估细胞毒性、摄取与膜片钳电生理；体内使用 CD-1 小鼠，于右坐骨神经束内注入 2 μL（2 mg/mL）纳米颗粒，在注射后第 1 天与第 5 天取坐骨神经、腰髓背侧、丘脑腹后外侧核（ventral posterolateral nucleus, VPL）与初级体感皮质后肢区（primary somatosensory cortex hindlimb region, S1HL）进行多光子显微成像与荧光定量，并以对侧组织及 scrRVG29 组为对照，同时检测肝、脾、肾以评估系统暴露。

研究结果

2.1 合成与表征 C、CS 与 CSS-UCNPs

通过 TEM、DLS 与 XRD 确认 CSS 结构呈柱状、水动力半径 31.7 nm；808 nm 激发下因 Nd³⁺ 敏化产生 Er³⁺ 520/541/661 nm 发射，惰性外壳抑制表面淬灭，发光增强，双对数斜率表明绿色与红色发射为双光子过程。

2.2 CSS-PEG-Mal、CSS-PEG-RVG29 与 CSS-PEG-scrRVG29 的合成与表征

FT-IR 确认肽偶联成功，PEG 化后水动力半径增至 42.9 nm，水溶液分散稳定且保留强上转换发射。

2.3 CSS-PEG-RVG29 的神经元摄取

MTT 显示 ≤500 μg/mL 时细胞存活率 >80%。原代皮质与脊髓神经元孵育 24 h 后，CSS-PEG-RVG29 荧光强度显著高于 CSS-PEG-Mal 与 scrRVG29 组（皮质约 6.8 倍，脊髓约 7.4 倍），证实 RVG29 特异性增强 nAChR 介导内吞。

2.4 CSS-PEG-RVG29 暴露原代神经元的功能评估

全细胞膜片钳记录显示，100 μg/mL 灌流 10 min 对脊髓神经元自发电位发放无显著影响（0.97 倍基线），皮质神经元发放率轻度升高（1.27 倍基线，p = 0.0349），提示材料急性作用微弱且具有细胞类型特异性。

2.5 CSS-PEG-RVG29 纳米颗粒的局部分布

坐骨神经注射后第 1 天 RVG29 组同侧神经荧光高于 scrRVG29 组但第 5 天显著下降（215.9→29.1×10³ a.u.），表明其启动逆向运输离开注射点；scrRVG29 组滞留更强，对侧神经无信号。

2.6 体内神经元逆向运输

腰髓背侧第 1 天无累积，第 5 天 RVG29 组荧光升至 132.3×10³ a.u.，scrRVG29 组仅 5.7×10³ a.u.，证明 RVG29 介导高效逆向轴突运输。

2.7 体内跨突触转位

第 5 天在左侧（对侧）VPL（2489.3 a.u.）与 S1HL（245.3 a.u.）检出 RVG29 组信号，显著高于同侧及 scrRVG29 组；S1HL 信号低于 VPL 符合“外周→脊髓/延髓→VPL（二级）→S1HL（三级）”突触接力稀释规律，证实跨突触转运。2.7.1 显示肝、脾、肾无积累，系统暴露可忽略。

讨论部分总结

研究人员指出，UCNPs 经 DSPE-PEG 包覆与 RVG29 偶联后兼顾水相分散、低毒与神经元靶向；体外摄取、膜片钳与体内示踪一致表明该平台借 nAChR 内吞—内体逃逸—dynein 逆向运输—突触传递模拟狂犬病病毒路径但无病毒细胞毒性。既往体外突触模型与本研究的在体序列显影相互印证。无机 UCNPs 进入脑实质后可能经类淋巴途径由小胶质细胞转运清除。相较于全身或鞘内给药，神经束内注入利用外周神经原生架构，靶向精确且脱靶低。

结论部分翻译

综上，研究人员开发的 CSS-PEG-RVG29 平台弥合了外周给药与 CNS 递送间的鸿沟。这些功能化 UCNPs 作为实时监测与模型 cargo 转运的双功能平台，展现了该系统在治疗递送中的通用性。极低细胞毒性与电生理功能保全凸显其安全性，而穿越跨突触通路的能力彰显其功能性精度。通过实现从外周向脊髓与脑的高效运输，该结构为未来临床与诊断神经应用中克服血脑屏障提供了重要前景。